SERS结合PCA-LDA分析鉴别鸡肉中硝基呋喃类代谢物的混合残留

郭红青 刘木华 袁海超 赵进辉 陶进江 陈 健 徐 宁

(1.江西农业大学工学院，江西 南昌 330045；2.江西农业大学生物光电及应用重点实验室，江西 南昌 330045)

1974年，Fleischmann等[5]从吸附在粗糙银电极表面的吡啶上发现了表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)效应。SERS技术是基于被测样品吸附在纳米溶胶颗粒表面，使其SERS信号强度比普通拉曼信号强度增强104～106倍，与普通拉曼光谱相比，具有极强的拉曼散射增强效应[6-7]。张璐涛等[8]应用SERS光谱法实现了蜂蜜中的金霉素残留检测，实际样本中金霉素加标回收率均为80%～120%。陈阳等[9]利用SERS光谱法结合化学计量学方法和支持向量回归(SVR)实现了芘与菲溶液的定量分析。主成分分析法(Principle component analysis，PCA)是一种将可能有相关性的一些变量通过线性变换转换为相对独立的变量的方法，在保留原始数据有效信息的前提下，降低数据的维数，且变量的总方差维持不变[10-12]。线性判别分析(Linear discriminant analysis，LDA)是通过降低不同物质类别内方差比例，扩大不同类别物质间的差异，以实现较高的判别正确率，使用线性判别分析可以得到数据的最佳分类特征[13-14]。张芳等[15]采用红外光谱结合化学计量学方法(PCA-LDA)实现对道地山药和非道地山药的有效判别，准确率分别为97.53%，98.88%。

试验拟通过简单的前处理方法对鸡肉样品中的AMOZ和AHD进行提取，然后利用SERS法结合PCA-LDA鉴别鸡肉中AMOZ和AHD残留类别(即无AMOZ和AHD残留、AMOZ残留、AHD残留和AMOZ+AHD残留共4类)，为动物源性食品中多抗生素残留鉴别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三黄鸡：江西农业大学农贸市场；

四氯金酸三水合物：金含量≥49.0%，美国Sigma-Aldrich公司；

AHD标准品(纯度约为99.3%)、AMOZ标准品(纯度约为99.5%)：购于中国标准物质网；

无水甲醇、乙腈、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸三钠、氯化钠等：分析纯，南昌精科科学仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

高速组织搅碎机：DS-1型，上海标本模型厂；

便携式拉曼光谱检测系统：包括计算机，海洋光学有限公司提供的QE65000型拉曼光谱仪、785 nm激光器、光纤及样品池等；

超声波清洗器：JK-50B型，合肥金尼克机械有限公司；

万用电磁炉：单联型，北京科技永兴仪器有限公司；

低速离心机：JW-1024型，安徽嘉文仪器装备有限公司；

漩涡混合器：VORTEX-5型，海门市其林贝尔仪器有限公司；

石英进样瓶：直径11.5 mm，高30 mm，北京瑞盛博源科技发展有限公司。

1.3 样品制备

1.3.1 AMOZ或AHD标准储备液的配制 称取适量AMOZ或AHD标准品于容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配成100 mg/L的AMOZ或AHD标准储备液，-4 ℃ 避光存放备用。

1.3.2 AMOZ+AHD混合标准储备液的配制 称取适量AMOZ和AHD标准品于容量瓶中，用超纯水并溶解定容，配成AMOZ+AHD混合标准储备液，-4 ℃避光存放备用。

1.3.3 鸡肉标准储备提取液的制备 取5.0 g搅碎的鸡肉样品，加入20 mL甲醇—水混合溶液(1∶1，体积比)，涡旋振动3 min，超声10 min，4 000 r/min离心10 min，弃上清液重复水洗1次，加入1 mol/L盐酸0.5 mL 于残留物中涡旋1 min加入AMOZ(或AHD、AMOZ+AHD)标准储备液20 mL，并涡旋1 min或不进行此操作(鸡肉空白提取液的制备)，加入乙腈10 mL和1 mol/L 氢氧化钠0.5 mL，涡旋振动3 min，超声10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，残留物再用10 mL乙腈重复提取1次，合并两次上清液，取10 mL提取液60 ℃ 水浴氮吹至近干，用适量超纯水定容，经0.45 μm有机相滤膜过滤，备用。通过该制备流程可分别得到含AMOZ或AHD的鸡肉标准储备提取液、鸡肉提取液混合加标储备液和鸡肉空白提取液。

1.3.4 不同浓度的AMOZ和AHD鸡肉提取液的制备

用鸡肉空白提取液将加标鸡肉提取液储备液稀释成不同浓度的混合工作溶液。

1.3.5 纳米Au溶胶的制备 根据文献[16]修改如下：加热0.01%氯金酸溶液(100 mL)至沸腾后，迅速加入 0.5%柠檬酸三钠溶液1.0 mL，并用玻璃棒搅拌加热10 min后，冷却到室温备用。

1.4 光谱测量

便携式拉曼光谱检测系统参数设置：根据文献[17]略作修改。785 nm激光器选择激光光源功率520 mW；拉曼光谱仪分辨率6 cm-1，平均信号强度0～60 000 au；采集光谱波段0～3 000 cm-1，平滑度1，积分时间10 s，积分2次，取平均值；选取拉曼光谱波段400～1 800 cm-1的光谱进行分析。

对鸡肉提取液进行拉曼光谱采集，根据文献[17]修改如下：将0.9 mL纳米Au溶胶、50 μL待测鸡肉提取液、100 μL NaCl溶液依次加入到2 mL石英进样瓶中，混合均匀后，放入样品池中采集其在吸附时间为0.5 min时的SERS光谱。

1.5 模型构建

1.5.1 样品预处理 先采用自适应迭代惩罚最小二乘法消除背景干扰，使用Matlab 2010软件进行操作；再对拉曼光谱强度进行最大值标准归一化预处理，将样品数据标准归一化，使用软件The Unscrambler X 10.1进行操作。

1.5.2 PCA分析 采用PCA对预处理后的数据进行降维处理，提取特征变量，使用软件The Unscrambler X 10.1进行操作。

1.5.3 LDA分析 使用The Unscrambler X 10.1软件进行LDA分析。总样本数280个，随机选取3/4的样本(210个样本)作为校正集样本[18]，建立判别模型；其余70个样本作为预测集样本，用分类正确率(即模型预测正确的样本数与总样本个数之比)来验证判别模型的有效性。将含AHD的鸡肉提取液样品、含AMOZ的鸡肉提取液样品、含AHD+AMOZ的鸡肉提取液样品、鸡肉空白提取液样品依次标记为1～4，进行模型识别。其中，含AHD的鸡肉提取液样品中AHD浓度为0.5～25.0 mg/L，含AMOZ的鸡肉提取液样品中AMOZ浓度为0.2～25.0 mg/L，含AHD+AMOZ的鸡肉提取液样品中AHD和AMOZ浓度分别为1.0～25.0，0.5～25.0 mg/L，鸡肉空白提取液样品不含AHD和AMOZ。

2 结果与分析

2.1 鸡肉样本的SERS光谱

由图1可知，通过单峰无法直接将鸡肉中残留的AMOZ和AHD类别分辨出来。

2.2 鸡肉中AHD和AMOZ残留的主成分提取

通过试验可知，前3个主成分对鸡肉中AHD和AMOZ残留的光谱数据的贡献率分别为57.77%，37.62%，3.31%，累计贡献率分别为57.77%，95.39%，98.70%；随着主成分数目的增加，主成分的贡献率越来越小，其中PC1贡献率最大，为57.77%；当主成分数目为3时，累计贡献率达98.70%，表明前3个主成分因子可代表原始数据信息中的大部分有效信息，在保证检测有效性的基础上，很大程度上消除了较多无用信息，提高了检测分析效率[19-20]。因此，选择前3个主成分绘制得分图。

a.纳米金胶 b.纳米金胶+氯化钠 c.鸡肉提取液 d.含AMOZ的鸡肉提取液 e.含AHD的鸡肉提取液 f.含AMOZ+AHD的鸡肉提取液

图1 SERS光谱图

Figure 1 The spectra of SERS

2.3 主成分得分

由图2可知，鸡肉提取液中只含AHD的样品绝大部分都分布在X轴、Y轴的正半轴及Z轴负半轴部分；鸡肉提取液中只含AMOZ的样品都聚集在一起，基本都在YZ平面；鸡肉空白提取液样品产生团簇现象，基本集中在XZ平面与YZ平面的交界处；而鸡肉提取液中含AHD和AMOZ两种代谢物的样品出现了分离现象，一部分与鸡肉提取液中只含AHD的样品重合，一部分与鸡肉提取液中只含AMOZ的样品重合，说明含AHD和AMOZ的鸡肉提取液样品的拉曼峰中不仅有只含AHD的鸡肉提取液样品的拉曼峰，还有只含AMOZ的鸡肉提取液样品的拉曼峰。从图2可以看出，应用主成分分析方法可以有效地鉴别出鸡肉提取液中是否含有AHD，是否含有AMOZ，但不能有效鉴别出含AHD和AMOZ的鸡肉提取液样品。

空心圆表示含AHD的鸡肉提取液；五角星表示含AMOZ的鸡肉提取液；三角形表示含AHD+AMOZ的鸡肉提取液；加号表示鸡肉空白提取液

图2 主成分得分三维散点图

Figure 2 3D scatter plot of PCA scores

2.4 模型及预测结果

由表1可知，在建立的模型中鸡肉空白提取液样本的校正集和预测集的判别正确率都达到了100%；只含AHD的鸡肉提取液样品的校正集的判别正确率为96.67%，预测集的判别正确率为100%；含AHD和AMOZ的鸡肉提取液样品的校正集的判别正确率为89.33%，预测集的判别正确率为96%；而只含AMOZ的鸡肉提取液样品的校正集的正确识别率较低，为63.33%，预测集的识别率为70%，可能是鸡肉中只含AMOZ时的拉曼峰会与鸡肉中同时含AHD和AMOZ时的拉曼峰有重合。

结合图2和表1可知，鸡肉中分别只含AHD和AMOZ的样品的主成分得分散点图均与鸡肉中同时含AHD和AMOZ的样品的得分散点图有部分重合，当模型识别时，很可能会将只含AHD的和只含AMOZ的样品被认为是鸡肉中同时含AHD和AMOZ的样品。但总体而言，模型校正集的判别正确率为90.48%，预测集的正确率为94.29%。故应用PCA-LDA建立的模型能有效识别鸡肉提取液中是否含AHD和AMOZ，且可以鉴别出鸡肉中AHD和AMOZ残留的类别。

表1 主成分—线性判别模型的结果

3 结论

试验以纳米Au溶胶和NaCl溶液为活性增强基底，应用SERS技术结合PCA-LDA对鸡肉中AHD和AMOZ残留进行识别分类。对鸡肉中AHD和AMOZ残留的4类样品建立的模型中，校正集的判别正确率为63.33%～100.00%，总的判别正确率为90.48%；预测集的判别正确率为70.00%～100.00%，总的判别正确率达到了94.29%。试验结果表明，与液相色谱、气相色谱等传统检测方法相比，应用PCA-LDA能快速鉴别出鸡肉中AHD和AMOZ残留的类别，是鸡肉中抗生素残留快速检测的发展趋势。后期可采用非加标样本来完善预测模型，进而为鸡肉中的其他抗生素残留快速检测的实现提供重要理论依据。