柳蒿芽醇提取物对结直肠癌和肝癌细胞的增殖活力的影响*

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(1.内蒙古科技大学包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古包头 014060；2. 内蒙古科技大学包头医学院临床医学学生)

恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一,正极大的威胁着人类的健康，并将成为本世纪人类的第一杀手[1]。肝癌(HCC)的发病率占全球癌症发病率的第五位，而其死亡率位居第三位。同样直肠癌(Rectal Cancer)作为危害人类健康的另一种恶性肿瘤，在我国，目前结直肠癌是第三位常见的癌，其中直肠癌约占其中的1/3。目前，肿瘤的治疗有手术、放化疗、介入等多种手段，但其死亡率依然居高不下。传统中医药作为我国的国粹，其中作为可以抗癌的中药以及中药的靶向治疗研究受到了极大关注。

柳蒿芽(Artemisia integrifolia )是菊科蒿属植物，又名蒌蒿、柳叶蒿等, 盛产于我区呼伦贝尔草原，是达斡尔族居民喜食的一种野菜，属多年生草本植物，可食、药两用。主治破血行瘀,上下通络。近年来，关于柳蒿芽食用价值的文献有一些报道，但对其它药理作用的研究非常有限。KK Ah等报道，柳蒿芽粗提物成分具有抗肿瘤作用。就此，本研究通过提取柳蒿芽醇提取物，作用于人肝癌细胞株HepG2和结直肠癌细胞株HCT116，观察对这两种细胞增殖活力影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 柳蒿芽：采自呼伦贝尔市阿荣旗镇；HepG2和HCT116细胞株：购自北京协和细胞库；RPMI1640培养基和DMEM培养基：胎牛血清购自四季青；购自美国GIBCO公司；PCNA抗体购自万类生物科技有限公司。

1.2仪器与设备 二氧化碳培养箱(美国，Thermo Fisher)；酶标仪(美国，Thermo Scientific MultiskanFC)；倒置显微镜(德国，徕卡)；96孔培养板(美国Corning公司)；电泳仪(美国，伯乐)

1.3方法

1.3.1柳蒿芽醇提取物的制备 将柳蒿芽置阴凉干燥处干燥，秤取干燥柳蒿芽560 g，80 %酒精浸泡过夜，在圆底烧瓶中加入沸石，安装冷凝管和加热套，80 ℃进行回流提取，待沸后保持60 ℃冷凝2 h，关闭电源。将圆底烧瓶中液体过滤出至干净的桶中。将收集好的液体进行旋转蒸发回收试剂。钳形瓶内物质永通浓度酒精溶出，倒入陶瓷盘中，用恒温水浴锅进行进一步蒸发，最后得到100g醇提取物。用石油醚萃取。

1.3.2细胞培养 HepG2细胞株采用含10 %的FBS及双抗的DMEM培养基培养，HCT细胞使用含10 %FBS及双抗的RPM11640培养基培养，置于37 ℃，5 %CO2，细胞长满70-80 %时进行实验处理。

1.3.3CCK8检测细胞生长作用 取对数生长期HepG2和HCT116细胞，转入96孔板，每孔细胞数为3000，培养24 h，去培养基，加入含柳蒿芽醇提取物的培养基继续培养，共设1-4组，第1组为阴性对照组，加含0.25 %DMSO各自的DMEM或1640培养基，第2-4组为柳蒿芽醇提物组，浓度分别为0.05 mg/mL、0.2 mg/mL、0.8 mg/mL复孔6个。培养24 h后，各孔各加入含10μl的CCK8，继续培养4 h，(注意误出现气泡)用酶标仪450 nM波长读各孔吸光度。细胞活力% = (加药细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD) ×100 %，实验重复三遍。

1.3.4Western blot 将HepG2和HCT116细胞接种于100mm培养皿中, 培养至贴壁面积达70-80 %左右时弃去培养液，按实验分组分别加入不同浓度的柳蒿芽醇提取物，分别为0.05 mg/mL、0.2 mg/mL、0.8 mg/mL，对照组不加药物。作用24h后,胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤三次。使用RIPA裂解液常规提取蛋白，使用BCA法进行蛋白定量。每孔20μg蛋白上样，10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白湿转到PVDF膜上, 用5%脱脂奶粉室温封闭1小时，加一抗稀释液(1∶1000稀释)，4 ℃过夜，TTBS洗膜10 min三次，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶2 000稀释) , TTBS洗膜10 min三次，用ECL化学发光剂曝光。以actin为内参，应用Image J成像分析系统进行条带扫描分析结果，结果以蛋白条带的面积积分值与actin的面积分值比值表示。实验重复3次。

1.3.5统计学处理 采用GraphPadPrism统计，数据采用t检验，P<0.05提示显著差异。

2 结果

2.1柳蒿芽醇提取物获得率 秤取阴干的柳蒿芽560 g，使用80 %的乙醇浸泡，热回流，旋转蒸发得到100 g的醇提取物，称取10 g，用石油醚进行萃取，得到1.1 g的醇提物浸膏，所以柳蒿芽醇提取物得率为1.9646 %。

2.2CCK8检测不同浓度柳蒿芽醇提取物对HepG2和HCT116细胞的增殖活力的影响 经过石油醚萃取的柳蒿芽醇提取物对人肝癌细胞株HepG2和结直肠癌细胞株HCT116均有增殖影响，差异具有统计学意义，并且这种细胞活力的降低呈现剂量依赖性。见表1。

2.3用Western blot检测不同浓度柳蒿芽醇提取物对细胞增殖活力相关蛋白PCNA表达的影响 Western blot检测中PCNA蛋白的表达，发现不同浓度的柳蒿芽醇提取物均可降低其表达，且存在剂量依赖性，这种差异具有统计学意义，这与细胞增殖检测的结果一致(见图1、2)。提示柳蒿芽醇提取物有抑制人肝癌细胞株HepG2和结直肠癌细胞株HCT116细胞增殖活性的作用。

表1 不同浓度柳蒿芽醇提取物对肿瘤细胞增殖活性的影响(n=3)

***：P<0.05,**：P<0.01均与对照组相比

图1 不同浓度柳蒿芽醇提取物对HepG2细胞PCNA蛋白表达的影响

图2 不同浓度柳蒿芽醇提取物对HCT116细胞PCNA蛋白表达的影响

3 讨论

我国作为一个发展中的人口大国，随着社会经济的发展,居民生活方式、饮食结构、环境状况的改变，以及老年化的加快[2]。恶性肿瘤面临的形势也愈发严峻。2007年导致我国城市居民死亡率最高的前三位疾病分别为恶性肿瘤、脑血管病、心脏病。尤其恶性肿瘤是我国城市居民的首位死因(其占城市死亡总数的28.53 % ,死亡率约为176123/10万，已经成为威胁人类生存的最大杀手[3]。虽然目前，肿瘤的治疗手段繁多，化疗药物更是层出不穷，但其死亡率依然居高不下。为此，更多肿瘤领域的专家、学者投入大量精力去研究和寻找治疗肿瘤切实有效的方法，近几年对中蒙药抗肿瘤作用的研究成为热点。

钱一鑫等报道白苞蒿内生真菌粗提物对人乳腺癌细胞系(MCF-7)和人前列腺癌细胞系(PC-3)、人骨髓白血病细胞系(HL-60)生长的均有抑制作用[4]。壁虎醇提物对人前列腺癌PC-3细胞和食管癌EC-109细胞的增殖抑制作用较强[5]。

柳蒿芽作为盛产于我区呼伦贝尔草原的一种药食两用的野菜。主治破血行瘀,上下通络。古代的医药典籍《神农本草经》中，蒌蒿被列为“上品，甘、平、无毒”，《本草纲目》草部第十五卷也有记载[6]:蒌蒿气味甘甜无毒,主治五脏邪气,风寒湿脾,补中益气,长毛发,久食轻身,耳聪目明,防衰。中医学中，柳蒿芽具有“破血行瘀，下气通络”之功能。关于其成分的研究，有文献显示，柳蒿芽富含多种矿物质、氨基酸和维生素[7]；其所含抗癌微量元素硒的含量相当高；此外柳蒿芽主要化学成分包括有机酸、生物碱、黄酮类、多糖等物质。近些年来针对柳蒿芽的研究，多是其栽培和化学成分的提取分离方面[8，9]，而药理学研究非常有限。

本研究通过提取柳蒿芽醇提取物，利用石油醚萃取后，采用不同浓度醇提取物作用于人肝癌细胞株HepG2和结直肠癌细胞株HCT116，发现柳蒿芽醇提取物可以抑制这两种细胞的增殖活性，并可以降低与肿瘤细胞增殖活性相关的蛋白PCNA的表达。本研究结果将为柳蒿芽成为抗肿瘤药物的研究、开发奠定了理论基础和试验指导。将来柳蒿芽这种在自治区产量丰富、食药两用的植物资源，如果能作为功能食品或治疗药物得以应用，必将产生良好的经济和社会效益。