苎麻根际加德拟鞘线虫的形态和分子鉴定

宋志强，杨喜爱，张晓伟，郭兵，肖爱平，肖清明，梅时勇

(中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205)

拟鞘线虫(HemicriconemoidesChitwood & Birchfield，1957)是一类植物根系迁移性外寄生线虫，主要分布于全世界较温暖地区，包括非洲、美洲、南欧、澳大利亚、东亚、南亚、东南亚等[1-2]。目前世界上报道拟鞘线虫的种类已达55种，我国记载的有18种[2]，可寄生和危害水稻、玉米、柑橘、芒果、荔枝、龙眼、香蕉、葡萄、枇杷、番石榴等作物和果树的根系，导致根系发育不良，植株生长衰退[3-4]。此外，拟鞘线虫侵染根系造成的伤口有利于真菌、细菌等植物病原物的侵染，加重对植物的危害。

苎麻(Boehmerianivea)俗称“中国草”，是一种多年生宿根性旱地草本纤维作物，我国苎麻种植面积和产量均占全世界总种植面积和产量的90%以上[5]。苎麻全株均可利用，目前主要应用于纤维纺织、动物饲料、食用菌培养基质、环保型麻地膜、土壤重金属污染修复、燃料乙醇、造纸等方面[6]。尽管我国苎麻栽培历史悠久，但目前尚未见拟鞘线虫为害苎麻的报道。

2018年11月，作者在湖南省益阳市苎麻线虫病的调查过程中，从苎麻根际土壤中分离到一种拟鞘线虫，通过形态学和分子生物学相结合的方法对该线虫进行鉴定，以明确苎麻根际拟鞘线虫的种类，从而为该病害的准确诊断和有效防治提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 样品采集和线虫分离

样品采自湖南省益阳市沅江市榨南湖村的苎麻根际，取样深度为5～25 cm，每份样品约500 g，放入封口袋中，标明寄主植物、采样地点、采样时间等，带回实验室。采用浅盘法分离土壤中的线虫。

1.2 形态学鉴定

将分离获得的线虫经温热杀死后，制成临时玻片，在尼康显微镜(Nikon E200型)下对线虫的整体形态和内部结构进行观察和拍照，采用de Man公式对线虫进行形态测计。

1.3 分子生物学鉴定

1.3.1 线虫DNA提取

参照宋志强等[7]的方法提取单条线虫的DNA。在体视显微镜下，用挑针挑取单条线虫放入含有8 μL ddH2O和1 μL 10×PCR buffer(Mg2+free)的0.2 mL PCR管中；将PCR管放入液氮中冷冻1 min后，再置于85 ℃下2 min，重复5次；向PCR管中加入1 μL 1 mg/mL蛋白酶K，56 ℃孵育15 min，95 ℃加热10 min，获得的DNA提取液可直接用于PCR扩增或者置于-20 ℃中保存备用。

1.3.2 PCR扩增

利用通用引物18s(5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和26s(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG -3′)[8]以及D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)[9]分别扩增线虫的rDNA-ITS区和28S rDNA-D2/D3区序列。PCR反应体系为25 μL，其中10×EasyTaqbuffer(含Mg2+)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L正反向引物各1 μL，5 U/μLEasyTaqDNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 5 μL，补足ddH2O至25 μL。反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 PCR产物的克隆及测序

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收、纯化后，与克隆载体pEASY-T1(北京全式金生物技术有限公司)连接，再转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中后，挑取阳性克隆送至北京擎科生物科技有限公司湖南分公司测序。测序获得的序列经BioXM 2.6软件拼接编辑后，提交至GenBank数据库获取序列号。

1.3.4 系统进化树构建

从GenBank数据库下载拟鞘属线虫的rDNA-ITS区和28S rDNA-D2/D3区序列，利用MEGA X软件中的ClustalW程序对序列进行比对，采用邻接法(neighbor-joinning method，NJ)构建系统进化树，并用Bootstrap值分析分支聚类的可靠性。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

从苎麻根际土壤中仅分离到拟鞘线虫的雌虫，未见到雄虫。雌虫形态特征及形态测计值见图1、表1。雌虫虫体圆柱形，热杀死后稍向腹面弯曲。体长387.0～464.8 μm，体环89～98个，环较宽大，平滑，不后翻，体中部体环宽3.5～5.6 μm(图1-A)。头部顶端平圆，有唇盘，唇环2个。口针发达，长63.6～74.7 μm，占13～22个体环，口针基部球前缘突起。具典型的环形食道，食道前体部与中食道球融合，中食道球发达，后食道腺梨形，与肠分界清楚。排泄孔位于肠的前端，到头端的距离为92.6～130.3 μm，体环23～30个(图1-B)。阴道向内前倾，单卵巢，前伸。阴门横裂，距肛门3～4个体环，距尾端9～13个体环。肛门距尾端5～10个体环。尾部呈圆锥形，末端钝圆(图1-C～F)。

本研究从苎麻根际分离得到的拟鞘线虫雌虫的形态特征和测计值与杨意伯等[4]和Decraemer等[10]描述的加德拟鞘线虫基本吻合，故将此拟鞘线虫群体初步鉴定为加德拟鞘线虫[Hemicriconemoidesgaddi(Loos, 1949)Chitwood & Birchfield, 1957]。该线虫隶属于垫刃目(Tylenchida)，垫刃亚目(Tylenchina)，环总科(Criconematoidea)，环科(Cricomenatidea)，环亚科(Criconematinae)，拟鞘线虫属(Hemicriconemoides)。

注：A：整体；B：体前部；C～F：尾部图1 加德拟鞘线虫雌虫的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of Hemicriconemoides gaddi female

表1 加德拟鞘线虫益阳群体与文献描述群体的雌虫测计值

Table 1 Morphometrics of females ofHemicriconemoidesgaddiYiyang population and the previous described population

测计特征益阳群体福州群体[4]巴布亚新几内亚群体[10]n203735L/μm413.5±19.6(387.0～464.8)481.0±26.6 (437.1～464.8)400.0±40.8(330.0～530.0)W/μm29.6±2.0 (27.2～35.7)29.5±1.4 (24.4～34.7)33.0±3.1(23.0～38.0)Stylet/μm67.6±2.8(63.6～74.7)67.9±3.7 (61.4～75.6)68.7±3.6(61.0～75.0)Tail/μm26.9±1.1 (25.0～28.2)28.3±4.0 (23.8～33.1)25.9±4.9(17.0～39.0)a14.0±1.0 (12.1～15.8)16.3±1.8 (14.2～18.6)12.3±1.7 (9.4～17.0)b3.8±0.5 (3.4～4.3)4.1±0.3(3.6～4.4)2.9±0.6(2.4～4.2)c15.4±2.0 (14.2～17.9)17.1±2.1(15.3～20.6)15.8±2.2 (11.2～20.0)V/%89.7±0.7 (88.7～91.2)89.7±0.6(88.7～90.6)89.3±1.6(83.4～92.0)Ex.P/μm114.4±8.5(92.6～130.3)138.7±9.6(120.5～151.4)111.4±3.2(86.0～143.0)VL/VB1.8±0.2(1.7～2.1)2.0±0.3(1.7～2.4)1.9±0.2(1.5～2.2)

续表1

测计特征益阳群体福州群体[4]巴布亚新几内亚群体[10]R94.5±2.3(89.0～98.0)103.0±5.0(96.0～109.0)104.8±3.2(99.0～110.0)RB4.7±0.5(3.5～5.6)3.2±0.2(3.0～3.6)-Rst16.1±2.0(13.0～22.0)18.0±1.0(16.0～19.0)-Rex27.0±1.8(23.0～30.0)31.0±2.0(28.0～34.0)32.2±1.2(30.0～35.0)RV10.9±1.0(9.0～13.0)13.0±1.0(12.0～15.0)11.5±1.3(9.0～16.0)Ran7.1±1.0(5.0～10.0)9.0±1.0(8.0～10.0)-RVan3.8±0.4(3.0～4.0)5.0±1.0(4.0～6.0)4.3±1.1(3.0～8.0)

注：n=样本数，L=体长，W=最大体宽，Stylet=口针长，Tail=尾长，a=体长/最大体宽，b=体长/头端至食道与肠连接处的距离，c=体长/尾长，V=阴门至头端的距离/体长×100，Ex.P. =排泄孔至头端的距离，VL/VB=阴门至尾端的距离/阴门处体宽，R=体环数，RB=虫体中部的体环宽度，Rst=唇盘至口针基部球之间的体环数，Rex=唇盘至排泄孔后第一环之间的体环数，RV=阴门至尾端之间的体环数，Ran=肛门至尾端之间的体环数，RVan=阴门至肛门之间的体环数。

2.2 分子生物学特征分析

测序结果表明，拟鞘线虫益阳群体rDNA-ITS区的扩增片段长度为997 bp(GenBank登录号：MK050499)，28S rDNA-D2/D3区片段长度为768 bp(GenBank登录号：MK050500)。序列分析结果显示，该群体的rDNA-ITS区序列与GenBank数据库中的加德拟鞘线虫福州群体(KC520471)相似性达97%，与其它拟鞘属线虫种的同源性约为82%～91%。该群体的28S rDNA-D2/D3区序列与加德拟鞘线虫福州群体(KC520470)相似性为97%，与其它种的序列同源性为86%～95%。从基于rDNA-ITS区和28S rDNA-D2/D3区序列构建的系统发育树可知(图2、 3)，该群体与加德拟鞘线虫处于同一进化分支上，与其它拟鞘属线虫进化关系较远。

综合形态学特征比较和分子生物学特征分析，从苎麻根际分离到的拟鞘线虫最终鉴定为加德拟鞘线虫。

图2 基于rDNA-ITS区序列构建的拟鞘属线虫系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of Hemicriconemoides species based on rDNA-ITS sequences

图3 基于28S rDNA-D2/D3区序列构建的拟鞘属线虫系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Hemicriconemoides species based on 28S rDNA-D2/D3 sequences

3 讨论与结论

加德拟鞘线虫益阳群体的形态特征与文献描述的巴布亚新几内亚群体[10]和福州群体[4]相符。益阳群体的形态测计值与巴布亚新几内亚群体相比，除体环数(89～98)和唇盘至排泄孔后第一环之间的体环数(23～30)分别比巴布亚新几内亚群体的(99～100)和(30～35)偏小外，其它测计值均与巴布亚新几内亚群体相吻合。益阳群体的口针长、尾长、b值、c值和VL/VB值与福州群体完全相符，其它测计值虽然存在一定差异，但均有范围重叠。同种线虫不同群体间存在形态测量差异，这些差异可能是由群体地理分布、土壤环境条件和寄主不同所致。

由于拟鞘线虫种类较多，种间形态学特征比较相似，仅依靠形态学特征难以进行准确鉴定，故需结合分子生物学方法对拟鞘线虫做进一步鉴定。目前拟鞘线虫的种类鉴定和系统发育分析主要采用rDNA(ITS序列、18S序列和28S序列)和mtDNA(COI序列)的部分序列[2, 11]。本研究利用rDNA的ITS区序列和28S的D2/D3区序列对苎麻根际的拟鞘线虫进行种类鉴定，结果表明，该拟鞘线虫益阳群体的rDNA-ITS区和28S rDNA-D2/D3区序列与GenBank数据库中的加德拟鞘线虫相似性均为97%，系统发育分析显示该线虫群体与加德拟鞘线虫的亲缘关系最近。因此，分子生物学方法进一步证明了该线虫群体为加德拟鞘线虫。

加德拟鞘线虫是Loos[12]于1949年在斯里兰卡茶树上首次发现，其后在美国、印度、巴布亚新几内亚、斐济、纽埃、萨摩亚、汤加等地均有报道，寄主包括茶树、咖啡、山茶等一些木本植物[10, 13]。在我国，加德拟鞘线虫于2013年在福建省福州地区首次被发现，主要寄生和危害龙眼、香蕉等果树[4, 14]。苎麻属于荨麻科苎麻属多年生草本植物，是加德拟鞘线虫的新寄主，该线虫对苎麻的危害程度还有待进一步研究。