高通量测序技术分析光叶珙桐根际土壤微生物多样性

程立君，王 磊，吴银梅 ，高兴国，师 睿 ，胡志芳

（1.昭通学院农学与生命科学学院，云南 昭通 657000；2.昭通高原特色农产品检测平台，云南 昭通 657000；3.昭通苹果产业研究所，云南 昭通 657000）

【研究意义】珙桐（Davidia involucrateBaill）又称为鸽子树，属珙桐科（Nyssaceae）珙桐属（Davidia）双子叶植物，是我国特有的第三纪古热带植物的孑遗树种，被列为国家一级保护植物［1-2］，具有很高的观赏价值和科研价值。但珙桐自然分布不连续，资源量很少，外界自然环境条件是影响其分布和繁育的主要因素，其中干旱是主要生态限制因子之一。因此可以尝试筛选珙桐根际微生物优势菌群，利用土壤微生物的活动能力，提升珙桐的逆境条件下的生存能力。【前人研究进展】自20世纪80年代以来，前人对珙桐的生物学、生态学、人工繁殖技术及引种栽培、生理生化以及分子生物学和遗传多样性等多个方面开展了大量的研究，并取得了一些进展，但在珙桐引种繁殖、植物化学成分等研究方向上还需更深层次的发展，尤其是在异地引种和开花结实方面研究不够成熟，限制了珙桐作为园艺观赏植物进行广泛栽培。有研究者对其繁育和引种开展了许多工作，但效果均不理想［3-5］，原因是珙桐对土壤干旱胁迫极为敏感［6］，耐旱能力较差［7］。土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的成分［8］，其参与物质循环代谢过程，在改善土壤理化性质、调节土壤养分的贮存和释放等方面起关键作用，并影响植物生长［9-10］，根际微生物多样性能缓解干旱和盐碱胁迫对植物生理的影响［11］，尤其是菌根菌能与植物根微系形成菌根共生体，菌根的物理生理特性能提高植物在逆境条件下的生存能力，如气候干旱、土壤贫瘠等障碍因素［12］，如胡杨根际微生物对胡杨的逆境抗性有重要作用，王珊珊［13］从胡杨根际土壤中筛选得到10株高效促生抗逆菌；有研究表明，丛枝菌根真菌（AMF）可提高青杨雌雄株抗旱性［14］。【本研究切入点】本研究尝试采用Illumina HiSeq高通量测序技术，对永善三江口、彝良县小草坝和镇雄塘房3个地区的光叶珙桐根际土壤中细菌和真菌的多样性进行研究，分析光叶珙桐自然条件下根际土壤微生物的共同特征与差异。【拟解决的关键问题】通过对比不同地区光叶珙桐根际土壤微生物多样性和主要菌群的差异，为今后筛选提高其抗旱能力的根际微生物和探索引种繁育新途径提供基础数据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2017年8月，从昭通地区3个光叶珙桐自然分布区（永善三江口、彝良小草坝、镇雄塘房）进行土样采集（避免雨季），具体操作是在每个地点用土壤取样器采集光叶珙桐根基土壤各5份，深度为0～40 cm，将在多个地点采集的土壤分别进行充分混合，并除去较大的石块、杂草、根系等杂物后，对获得的3个土样分别采用四分法留取土样，于-80℃冷冻保存，用于土壤微生物多样性分析。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤微生物总DNA提取 准确称取0.30 g土壤样品，采用OMEGA试剂盒法提取土壤样品中微生物总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，用Mini Dorp测定DNA纯度和浓度。

1.2.2 PCR扩增及测序 样品总DNA提取后，采用Illumina HiSeq 2500测序平台的通用引物对细菌16S rRNA V3+V4区域和真菌ITS1区域分别进行PCR扩增。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性35 s、57℃退火30 s、72℃延伸40 s，30个循环；72℃延伸5 min。对扩增产物进行纯化、定量和均一化，形成测序文库，由北京百迈客生物科技有限公司通过Illumina HiSeq 2500进行测序。PCR扩增通用引物包括V3+V4区域（428 bp）引物（上游引物5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，下游引 物 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'） 和真菌ITS1区域（187～298 bp）引物（上游引物5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，下游引物5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。

1.3 数据分析与处理

1.3.1 生物信息学分析 原始数据存在一定的干扰数据，先将测得的原始序列截去Barcode序列和引物序列，使用FLASH v1.2.7软件，通过overlap对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列即原始Tags数据（Raw Tags）；使用Trimmomatic v0.33软件，对拼接得到的Raw Tags进行过滤，得到高质量的Tags数据（Clean Tags）；使用UCHIME v4.2软件鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据（Effective Tags）。使用QIIME软件中的UCLUST对Tags在97%的相似度水平下进行聚类，获得OTU，统计各个土壤样品每个OTU中的丰度信息。采用随机抽样的方法抽取数据，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建曲线，即稀释性曲线，利用Mothur软件和R语言工具绘制稀释曲线图。

1.3.2 物种组成分析 基于Silva（细菌）和UNITE（真菌）分类学数据库对OTU进行分类学注释，确定序列的分类信息，获得门、纲、目、科和属各水平下的分类单元。利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图。

1.3.3 多样性分析 Alpha多样性反映的是单个样品物种丰度及物种多样性，有Chao1、Ace、Shannon、Simpson等多种衡量指标。基于OTU的结果，利用Mothur软件计算丰富度指数（Chao、Ace）和Alpha多样性指数（Shannon、Simpson）来进行生物多样性分析。使用QIIME软件进行Beta多样性分析，比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度。基于各样品序列间的进化信息的差异来计算样品间的差异，利用距离算法（binary、bray、weighted、unweighted）得到样品间的距离矩阵，通过R语言工具绘制样品热图（Heatmap）和采用非加权配对平均法（UPGMA）对样品进行层次聚类绘制系统发生树。

2 结果与分析

2.1 光叶珙桐根际土壤细菌和真菌OTU水平分析

经数据前处理，3个样品（永善三江口、彝良小草坝和镇雄塘房）总DNA的16S rDNA V3+V4区经测序分析得到67 712～68 829条有效序列数据（表1），序列长度集中在390～450 bp之间，平均长度分别为419、415、421 bp，从序列长度来看，与16S rDNAV3+V4区序列长度大致吻合，进行聚类后分为2 293个OTUs（序列相似性＞97%）。3个样品总DNA的ITS区经测序分析得到69 510～69 717条有效序列数据（表1），序列长度集中在160～340 bp之间，平均长度分别为230、218、244 bp，进行聚类后分为880个OTUs。从3个土样中细菌和真菌的rarefaction曲线（图1）可以看出，随着测序数量的增加，它们所能代表构建的OTU数目增加，曲线的斜率逐渐上升，后趋于平缓，同时样品所得到的序列的覆盖度均高于90%，说明本研究测序数据量合理，可反映样品中微生物群落的种类和结构。

2.2 光叶珙桐根际土壤微生物物种组成分析

本研究检测到的细菌和真菌种类繁多，其中很多物种的含量非常少，为使视图效果最佳，柱状图只显示丰度水平排名前10的真菌和细菌优势菌，并将其他物种合并为Others在图中显示，Unknown代表未得到分类学注释的物种，以相对丰度为纵坐标绘制柱形图。图2A和图2B分别展示了样品中相对丰度排名前10个纲的细菌和真菌，表明光叶珙桐根际土壤中细菌主要分布于以下10个纲：α-变形菌纲Alphaproteobacteria、Subgroup_6、δ-变 形 菌 纲 Deltaproteobacteria、γ-变形菌纲Gammaproteobacteria、酸杆菌纲Acidobacteria、β-变形菌纲 Betaproteobacteria、索利氏菌纲Solibacteres、Subgroup_2、放线菌纲Actinobacteria、芽单胞菌纲Gemmatimonadetes（图2A），其中α-变形菌纲Alphaproteobacteria最丰富，在3个土样中相对丰度分别为19.37%、18.48%、17.02%。永善三江口、镇雄塘房土样中主要细菌种类的相对丰度比较相近，与彝良小草坝土样差异较大，尤其是在Subgroup_2和算杆菌纲Acidobacteria的相对丰度分别高达14.93%和10.05%，而在永善三江口土样（0.36%、2.50%）和镇雄塘房土样（0.04%、0.14%）中含量较低；真菌主要分布于以下10个纲：粪壳菌纲Sordariomycetes、伞菌纲Agaricomycetes、古菌纲 Archaeorhizomycetes、Mortierellomycotina_cls_Incertae_sedis、盘菌纲Pezizomycetes、散囊菌纲Eurotiomycetes、座囊菌纲Dothideomycetes、球囊菌纲Glomeromycetes、锤舌菌纲Leotiomycetes、银耳纲Tremellomycetes（图2B），不同地区的土样中真菌菌群分布有明显差异，在永善三江口土样中相对丰度最高的3个种类是盘菌纲Pezizomycetes（17.01%）、粪壳菌纲Sordariomycetes（15.04%）、Mortierellomycotina_cls_Incertae_sedis（7.64%），在彝良小草坝土样中相对丰度最高的3个种类是古菌纲Archaeorhizomycetes（29.79%）、伞菌纲Agaricomycetes（20.90%）、粪 壳 菌 纲 Sordariomycetes（4.87%）， 在 镇雄塘房土样中相对丰度最高的3个种类是粪壳 菌 纲 Sordariomycetes（20.77%）、 伞 菌 纲Agaricomycetes（10.53%）、Mortierellomycotina_cls_Incertae_sedis（8.35%）， 其 中 盘 菌 纲Pezizomycetes在永善三江口土样中相对丰度为17.01%，而在彝良小草坝和镇雄塘房土样中含量很低或未检测出，伞菌纲Archaeorhizomycetes在彝良小草坝土样中相对丰度为29.79%，而在永善三江口、镇雄塘房土样中含量很低甚至未检测出。相对丰度大于1%的种类在3个样品中都有分布的只有伞菌纲Agaricomycetes、Mortierellomycotina_cls_Incertae_sedis和粪壳菌纲Sordariomycetes，其中伞菌纲Sordariomycetes在3个样品中都具有较高的相对丰度，分别为15.04%、4.87%、20.77%。

表1 光叶珙桐根际土壤样品测序的tags信息及OTU统计分析Table 1 Tags information and OTU statistical analysis of rhizosphere soil sample sequencing of D. involucrate

图1 光叶珙桐根际土壤样品细菌和真菌测序的稀释曲线Fig. 1 Dilution curves of bacterial and fungi sequencing of rhizosphere soil samples of D. involucrate

图2 光叶珙桐根际土壤样品细菌群落和真菌群落分布Fig. 2 Distribution of bacterial community and fungi community in rhizosphere soil samples of D. involucrate

2.3 光叶珙桐根际土壤微生物多样性分析

2.3.1 Alpha多样性分析 从Alpha多样性指数结果（表2）可以看出，3个样品都具有较高的细菌和真菌群落多样性。3个土样中细菌群落多样性Chao1指数平均值和Shannon指数平均值表现为永善三江口＞镇雄塘房＞彝良小草坝，可见永善三江口光叶珙桐根际土壤细菌多样性最丰富；真菌群落多样性Chao1指数值表现为镇雄塘房＞彝良小草坝＞永善三江口，Shannon指数值表现为镇雄塘房＞永善三江口＞彝良小草坝。可见，光叶珙桐根际土壤真菌丰富度方面镇雄塘房＞彝良小草坝＞永善三江口，多样性方面镇雄塘房＞永善三江口＞彝良小草坝。

表2 光叶珙桐根际土壤样品根际土壤群落多样性指数Table 2 Community diversity index of rhizosphere soil samples of D. involucrate

2.3.2 Beta多样性分析 图3为基于距离算法（Unweighted）得到3个土样间的距离矩阵，通过R语言工具绘制样品热图Heatmap，根据颜色变化可以看出样品间的差异性，结果表明永善三江口和镇雄塘房地区光叶珙桐根际土壤中细菌菌群（图3A）和真菌菌群（图3B）的相似性均较高。

图3 光叶珙桐根际土壤样品加权UniFrac的heatmap图Fig. 3 Heatmap diagram of Weighted Unirac of rhizosphere soil samples of D.involucrate

根据每个样品OTU的组成情况，基于Beta多样性分析得到的距离矩阵，通过R语言工具采用非加权配对平均法（UPGMA）对样品进行层次聚类，可以判断样品间物种组成的相似性，图4是3个土样中细菌和真菌OTU丰度的聚类分析结果，样品越靠近，枝长越短，说明两个样品的物种组成越相似，结果显示永善三江口和镇雄塘房地区OTU水平相似，与彝良小草坝地区根际细菌和真菌菌群的相似性较低。

图4 基于OTU的光叶珙桐根际土壤样品样本树状聚类结果Fig. 4 Clustering diagram of rhizosphere soil samples of D. involucrate based on the OUT

3 讨论

珙桐根际土壤微生物多样性研究报道较少，杨敬天等［15］对珙桐土壤微生物数量及其与土壤因子的关系做过报道，但未能反映微生物种类信息、丰度和群落结构等情况。本研究采用Illumina HiSeq高通量测序技术相较于传统分子生物学方法，该技术覆盖了整个土壤微生物群落的信息，能准确反映微生物群落的种类、丰度和分布。秦越等［16］研究认为，连作会导致马铃薯根际土壤从“细菌型”向“真菌型”土壤转化。通过对永善三江口、彝良小草坝和镇雄塘房3个地区光叶珙桐根际土壤微生物多样性分析结果表明，永善三江口的光叶珙桐根际土壤细菌多样性最丰富，镇雄塘房的光叶珙桐根际土壤真菌多样性最丰富。罗柏青等［17］对滇东北珙桐群落调查的结果显示，永善三江口和彝良小草坝珙桐径级分布呈现出稳定增长的金字塔型，种群处于稳定阶段。夏嘉禹等［18］对镇雄县珙桐群落结构调查结果显示呈现倒金字塔形更新较差，处于衰退阶段。该珙桐群落结构的调查结果与本研究3个地区光叶珙桐根际土壤微生物多样性结果相吻合，珙桐种群稳定的地区（永善三江口和彝良小草坝）根际土壤细菌多样性较丰富，种群处于衰退阶段的地区（镇雄）光叶珙桐根际土壤真菌多样性较丰富。光叶珙桐根际土壤细菌和真菌多样性的这种变化与光叶珙桐自然分布区种群结构变化是否也存在联系还有待进一步研究。

4 结论

永善三江口、彝良县小草坝和镇雄塘房3个地区光叶珙桐根际土壤中细菌和真菌物种组成丰富，但不同地区光叶珙桐根际土壤中微生物种群结构有一定差异。在纲分类水平上，细菌中α-变形菌纲Alphaproteobacteria是最优势纲，永善三江口、彝良县小草坝和镇雄塘房3个地区的相对丰度分别为19.37%、18.48%、17.02%，真菌中只有粪壳菌纲Sordariomycetes在3个样品中都具有较高的相对丰度，分别为15.04%、4.87%、20.77%，其他丰度较高的种类都存在明显差异。通过微生物种群结构分析结果显示，永善三江口与镇雄塘房的光叶珙桐根际土壤微生物种群结构的相似性较高，其中永善三江口光叶珙桐根际土壤细菌多样性最丰富，镇雄塘房光叶珙桐根际土壤真菌多样性最丰富。