鼠尾草酸对大鼠大脑中动脉阻断引起的 局灶性脑缺血的保护作用

*

1.昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500； 2.昆明医科大学实验动物学部，云南 昆明 650500；3.昆明医科大学生物医学工程中心，云南 昆明 650500

“脑卒中”(cerebral stroke)又称“中风”、“脑血管意外”，属于急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。脑缺血具有发病率高、病死率高和致残率高等特点[1 -2]。脑缺血的发生将会导致兴奋性氨基酸毒性[3]、氧化应激[4]、炎症反应[5]、DNA 损伤等一系列病理生理过程，最终导致神经元损伤以及凋亡[6]。鉴于大鼠脑血管特征与人比较相似[7]，在进行脑缺血相关疾病研究时往往采用的实验动物模型是大鼠大脑中动脉阻塞模型[8]，其制备方法较多有线栓法、开颅法、光化学诱导血栓法等。本实验采用改良线栓法，具有出血少，模型稳定，成活率高等特点[9]。

近年来，寻找对脑缺血再灌注损伤有良好治疗作用的多靶点药物的研究是当前研究的热点，已知具有多靶点作用优势的传统中药迷迭香(Rosmarinus officinalis Linn.) 是一种具有丰富使用价值的植物，含有大量的抗氧化成分，其中，迷迭香的主要成分鼠尾草酸(Carnosic acid，CA)是一种天然的植物酚类物质[10]，具有抗微生物[11- 12]、抗氧化[13- 14]、抗肿瘤[15]、抗炎[16]、神经保护[17]以及保护肝脏[18- 19]等作用。在课题组前期研究中[20]，发现迷迭香脂溶性提取物对大鼠大脑中动脉局灶性缺血有较好的保护作用，本实验采用大鼠大脑中动脉阻塞模型，观察鼠尾草酸预处理对大鼠大脑中动脉阻断引起的局灶性脑缺血的保护作用，以期为治疗脑卒中提供理论依据和思路参考。

1 材料与方法

1.1 试验药物 鼠尾草酸(批号：BCSW180530-1，西安百川生物科技有限公司)，灯盏花素片(批号:161101，昆明全新生物制药有限公司)、尼莫地平片(批号：170201，亚宝药业集团股份有限公司)临用时加入0.5%的羧甲基纤维素钠研磨配成混悬剂。

1.2 动物 SPF级健康SD雄性大鼠，体重(200±20)g，购于昆明医科大学实验动物学部，实验动物生产许可证号：SCXK(滇)K2015-0002，置于普通环境，饲养一周左右。

1.3 试剂 PBS缓冲液(批号:11310227，solarbio)、多聚甲醛(批号：20130416，广州光华科技股份有限公司)、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，批号：409E033，北京西浓科技有限公司)、凝血酶原时间测定液体试剂盒(批号：STY20101-3B，泰州中勤世帝生物科技有限公司)、活化部分凝血活酶时间测定试剂盒(批号：STY20201-3)、凝血酶时间测定液体试剂盒(批号：STY20301-5)、纤维蛋白原含量测定液体试剂盒(批号：STY20401-5)均为泰州中勤世帝生物科技有限公司。

1.4 仪器 离心机(Thermo Fisher)、冰冻切片机(Leica)、37°恒温箱(BINDER)、半自动血小板聚集仪(北京世帝科学仪器有限责任公司)、血常规分析仪(日本希森美康sysmex XT-2000i)。

1.5 方法

1.5.1 动物分组 将健康SD大鼠随机分为7组，每组6只。假手术组、模型组给予同体积的溶剂，尼莫地平10 mg/kg组、灯盏花素40 mg/kg组、鼠尾草酸180 mg/kg组、鼠尾草酸90 mg/kg组、鼠尾草酸45 mg/kg组，连续灌胃7 d，于末次给药30 min后，采用改良线栓法制备大鼠MCAO模型。

1.5.2 MCAO模型制备[21-23]术前12 h禁食(不禁水)。称重后腹腔注射3.6%水合氯醛进行麻醉。暴露颈部备皮，依次用碘伏，酒精消毒。用手术刀沿颈部的正中线偏右2 mm切一条1.5 cm左右的切口，暴露颌下腺，顿性分离右侧胸锁乳突肌肌肉与胸骨舌骨肌，此时用自制拉钩将其向两侧牵引，充分暴露颈总动脉(Common Carotid Artery CCA)，游离出CCA后，分别在两端悬挂2根3-0丝线，结扎近心端，远心端系活结以不出血为度。显微镊挑起近心端丝线绷直CCA，在距CCA分叉4 mm处将针头斜方向刺入，轻轻退出针头，随即缓慢插入线栓，进线深度控制在(17±0.5)mm，送入颈内动脉后结扎远心端并固定线栓，剪去多余的线栓及丝线，撤去拉钩，消毒，缝合皮肤。假手术组只插入线栓，不阻断大脑中动脉。

1.5.3 Zealonga评分[24]分别于术后6、12、24 h参照Zea-Longa 5分制评分标准评分：无神经损伤症状为0分；大鼠前肢患侧对侧呈屈曲为1分；大鼠自发行走时向患侧对侧转圈为2分；大鼠身体向患侧对侧倾倒为3分；大鼠丧失意识无法自发行走为4分。评分越高提示神经功能损伤越严重。

1.5.4 PRP、PPP制备方法 各组动物于24 h后腹腔注射3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉，开胸暴露心脏，取全血加入3.28 %枸橼酸钠(9∶1)抗凝，颠倒混匀，800 r/min，离心12 min,收集上层，即PRP，再以2500 r/min，离心10 min，收集上清即PPP。

1.5.5 ADP诱导血小板聚集率测定 ADP粉末购置于泰州中勤世帝生物科技有限公司，按试剂说明书操作。

1.5.6 血浆制备方法 另取一份全血加入3.28%枸橼酸钠(9∶1)抗凝，颠倒混匀，3000 r/min，离心10 min，收集上层清液，即为血浆。

1.5.7 血浆TT、PT、APTT、FIB的测定 检测试剂盒购置于泰州中勤世帝生物科技有限公司，按试剂盒说明书操作。

1.5.8 TTC染色 大鼠麻醉，迅速开胸暴露心脏，灌注生理盐水，迅速开颅取脑，去除嗅球、小脑以及低位脑干，于-20 ℃冷冻切片机中速冻7 min，沿冠状位将鼠脑切开成5片，每片厚度约2 mm。置于1% TTC磷酸盐缓冲液中37℃避光孵育，每隔10 min翻一面，30 min后吸净TTC，用4 %多聚甲醛固定24 h后拍照，用Image J测定脑梗死面积，计算梗死面积百分比。

2 结果

2.1 Zealonga评分 术后6、12、24 h 对实验大鼠进行Zealonga评分，结果显示各组大鼠神经功能损伤表现出一定的差异，与假手术组相比，模型组出现显著的神经功能损伤，提示建模成功。术后24 h，鼠尾草酸90 mg/kg组与模型组相比，明显改善大鼠神经功能损伤，差异具有统计学意义(P<0.05)；鼠尾草酸180 mg/kg组能改善大鼠神经功能损伤，效果与尼莫地平组、灯盏花素组相当，甚至更优，结果见表1。

组别剂量/mg/kg 行为学评分/分 6h12h24h假手术0.00±0.000.00±0.000.00±0.00模型1.80±0.45△△2.60±0.55△△3.60±0.55△△尼莫地平101.80±0.452.00±0.002.92±1.02灯盏花素402.00±0.002.20±0.453.00±0.58鼠尾草酸1801.80±0.452.20±0.452.50±0.50鼠尾草酸902.00±0.002.00±0.002.25±0.43∗鼠尾草酸451.80±0.452.60±0.553.00±0.00

注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

2.2 血小板聚集率、TT、PT、APTT、FIB测定结果 与假手术组相比，各组大鼠血小板聚集率有上升的趋势，纤维蛋白原含量(FIB)明显升高，凝血酶原时间(Prothrombin Time, PT)、凝血酶时间(Thrombin Time，TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)均有下降趋势。与模型组比较，鼠尾草酸180 mg/kg组能明显降低ADP诱导的血小板聚集率，延长APTT，显著性降低FIB含量；鼠尾草酸90 mg/kg组能有效延长APTT，明显降低FIB含量；鼠尾草酸45mg/kg组能显著性降低FIB；尼莫地平组能显著性降低FIB含量；灯盏花素组能明显延长APTT，明显降低FIB含量，结果见表2。

组别剂量/mg/kg血小板聚集率/%TT/sPT/sAPTT/sFIB/g·L-1假手术0.27±0.0328.00±3.3112.88±1.4726.07±3.912.85±0.25模型0.30±0.0527.87±3.1011.95±1.5120.05±2.973.26±0.43△尼莫地平100.30±0.0527.55±3.6612.27±1.4326.70±5.202.67±0.33∗∗灯盏花素400.30±0.0529.13±3.6111.68±1.2528.03±2.93∗2.81±0.36∗鼠尾草酸1800.24±0.02∗30.72±2.7411.72±2.1931.50±5.10∗2.61±0.26∗∗鼠尾草酸900.26±0.0628.30±3.4010.42±0.7840.70±3.90∗2.85±0.43∗鼠尾草酸450.25±0.0430.75±3.8212.63±2.0934.30±9.912.32±0.13∗∗

注：与假手术组比较，△P<0.05；与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

2.3 脑梗死面积检测结果

2.3.1 TTC染色结果 与模型组比较，假手术组冠状切面未见明显梗死区域，实验组大鼠大多数可见皮质部有较多的梗死区(白色)，与非梗死区(红色)界线较明显，结果如图1所示。

2.3.2 梗死面积百分比 与模型组相比，鼠尾草酸180 mg/kg组、鼠尾草酸90 mg/kg组和尼莫地平组大鼠的脑梗死面积百分比明显缩小，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图2所示。

2.4 血常规检测结果 与假手术组比较，模型组中性细胞比率、网织红细胞数、高荧光网织红比率明显升高，白细胞明显下降；与模型组比较，尼莫地平组中性细胞数、单核细胞明显下降；灯盏花素组单核细胞比率、单核细胞显著降低；鼠尾草酸180 mg/kg组白细胞、血小板、中性细胞数、单核细胞明显升高，血红蛋白、平均血小板体积、平均血红蛋白量、平均血红蛋白浓度、中性细胞比率明显下降；鼠尾草酸90 mg/kg组血小板、血小板压积、嗜碱性粒细胞、低荧光网织红比率升高，红细胞平均体积、淋巴细胞比率、嗜酸性粒细胞、高荧光网织红比率、未成熟网织红细胞分数明显降低；鼠尾草酸45 mg/kg组白细胞、淋巴细胞数、单核细胞、中荧光网织红细胞比率明显升高，平均血小板体积、淋巴细胞比率、红细胞分布宽度、血小板分布宽度、大型血小板比率明显下降，其他指标无明显改变，结果见表3。

测定项目假手术模型尼莫地平10mg/kg灯盏花素40mg/kg鼠尾草酸180mg/kg鼠尾草酸90mg/kg鼠尾草酸45mg/kg白细胞(×109/L)5.38±0.693.95±0.83△3.60±0.733.73±1.006.86±2.07∗∗4.35±0.496.46±1.11∗∗红细胞9.35±0.739.66±1.529.32±0.919.01±1.649.17±0.1510.35±0.468.45±0.50血红蛋白(g/L)172.17±20.88183.33±27.36167.50±21.62158.33±28.26147.20±20.80∗∗193.50±21.60160.00±10.41红细胞压积(%)53.10±3.1453.73±4.8554.86±5.1753.45±4.9955.31±2.7958.30±1.5050.13±4.23血小板( ×109/L)919.50±85.53810.00±88.12816.08±73.61788.17±109.78958.00±133.91∗927.50±77.91∗783.50±79.92平均血小板体积(fL)7.58±0.207.80±0.247.73±0.387.83±0.367.02±0.26∗∗7.70±0.157.13±0.13∗∗血小板压积0.70±0.080.63±0.060.64±0.060.62±0.070.67±0.080.72±0.07∗0.56±0.05红细胞平均体积(fL)56.92±3.0959.13±1.9458.87±1.5958.72±3.0659.18±1.5056.43±2.00∗59.28±2.02平均血红蛋白量(pg)17.97±1.4720.27±1.9418.08±2.6418.62±3.4816.08±2.44∗∗18.80±2.4819.03±1.69平均血红蛋白浓度(g/L)323.83±26.74343.33±22.32307.50±45.77333.67±42.05271.40±38.14∗∗332.25±37.70322.75±39.51中性细胞比率(%)31.38±6.2443.53±7.46△△37.31±2.9046.20±10.5732.88±5.65∗41.45±8.2542.42±6.09淋巴细胞比率(%)63.50±10.1462.68±10.6656.07±9.1252.46±10.9454.33±7.3347.55±8.18∗∗46.02±8.10∗∗单核细胞比率(%)6.92±1.638.70±1.948.32±1.586.21±0.69∗10.63±3.038.78±1.119.10±3.38嗜酸性粒细胞比率(%)0.85±0.470.77±0.590.73±0.560.32±0.200.22±0.130.00±0.000.45±0.32中性细胞数(×109/L)1.84±0.601.94±0.451.36±0.33∗1.74±0.422.45±0.29∗1.59±0.212.15±0.31淋巴细胞数(×109/L)3.20±0.172.54±0.402.06±0.322.16±0.552.89±0.532.06±0.383.30±1.20∗单核细胞0.37±0.090.40±0.030.26±0.09∗0.20±0.06∗∗0.88±0.18∗∗0.45±0.130.68±0.12∗嗜酸性粒细胞0.02±0.010.01±0.010.02±0.010.01±0.010.02±0.010.00±0.00∗0.03±0.02嗜碱性粒细胞0.00±0.000.40±0.630.50±0.840.30±0.390.40±0.490.75±0.390.25± 0.39

续表3

测定项目假手术模型尼莫地平10mg/kg灯盏花素40mg/kg鼠尾草酸180mg/kg鼠尾草酸90mg/kg鼠尾草酸45mg/kg红细胞分布宽度(%)31.08±2.3431.23±1.8331.72±1.7830.33±1.2430.12±0.9830.80±1.3228.98±0.76∗RDW-CV18.17±1.9616.70±1.9617.72±1.7716.72±2.1717.44±0.3819.33±0.5315.35±0.58血小板分布宽度(fL)8.65±0.268.82±0.518.65±0.598.73±0.667.72±0.40∗8.95±0.387.70±0.14∗大型血小板比率(%)8.25±1.199.82±1.679.42±2.4210.12±2.416.12±1.59∗∗9.58±1.106.63±0.73∗∗网织红细胞数0.21±0.050.2600±0.04△0.26±0.050.23±0.040.19±0.02∗0.25±0.030.26±0.06中荧光网织红细胞比率16.98±2.4419.50±2.7517.50±3.2718.87±2.7816.78±2.7615.27±2.67∗22.35±2.70高荧光网织红比率11.49±1.2318.73±3.74△17.62±6.2413.06±4.8817.12±2.208.49±1.01∗23.72±5.10网织红细胞百分比2.2700±0.45002.8500±0.54002.8500±0.54002.6500±0.64002.1100±0.16002.5700±0.25002.7600±0.3000低荧光网织红比率71.30±5.6464.32±7.6665.98±8.2672.97±9.9266.10±4.8979.35±5.78∗∗56.68±11.58未成熟网织红细胞分数28.70±5.6437.20±7.6934.02±8.2630.63±6.4633.90±4.8920.65±5.78∗∗43.33±11.58

注：与假手术组比较，△P<0.05,△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

目前我国每年新发脑血管病患者约270万，死于脑血管病的患者约130万，脑卒中已成为中国居民第一位死因，严重威胁人类健康、影响生活质量，是现代社会致死和致残率极高的疾病。当大脑发生局部急性脑缺血时，会引起缺血中心区域梗死，而梗死周围区域又称为缺血半影区，该区域损伤可逆。因此，对于脑缺血的治疗主要着手于恢复血供和保护半影区神经元[25]。目前，临床上用于治疗脑缺血的方法有抗氧化、溶栓、降颅压、抗血小板聚集等[26]。天然抗氧化剂鼠尾草酸为唇形科迷迭香属植物迷迭香的主要活性成分，具有抑制血小板聚集[27]、保护H2O2损伤的神经元[10]、抗氧化[28]、诱导肝癌细胞凋亡[15]、预防葡聚糖硫酸钠诱导的急性肠炎[29]等作用。

局灶性脑缺血后，大鼠神经功能评分和TTC染色结果显示，鼠尾草酸预处理组大鼠神经功能损伤得到明显改善，能明显缩小脑梗死面积百分比，对脑缺血损伤表现出一定的保护作用。此外，鼠尾草酸还能够抑制血小板聚集，延长ATPP，降低纤维蛋白原(FIB)含量，进而影响大鼠血常规生理指标。

综上所述，鼠尾草酸对脑缺血疾病有一定的保护作用，本项目的开展，为脑缺血再灌注损伤的治疗提供一种新型多靶点药物，有望为云南特色丰产植物迷迭香治疗脑卒中提供了理论基础和开辟了新思路，为预防和治疗心脑血管疾病提供新药候选，具有重要的科学价值和现实意义。