种猪场猪瘟病原和抗体检测与分析

赵海忠，李良华，宋忠旭，孙 华，彭先文，梅书棋

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064）

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的猪的一种接触性传染病，以高热、出血和高死亡率为特征，传播途径广泛[1]。在我国现阶段猪瘟持续散发，以隐性、温和型感染为主，流行态势复杂，是阻碍我国养猪业发展的主要疫病之一[2-3]。种猪场开展猪瘟净化，从源头上控制疾病的传播，对保障种猪场的健康、稳定发展具有重要意义[4]。2018年湖北某规模化种猪场进行了猪瘟病原、免疫抗体水平检测，拟通过淘汰猪瘟野毒感染猪、抗体阴性猪群补打猪瘟活疫苗等管理措施，实现猪瘟净化。

1 材料与方法

1.1 材料

采集公母猪群扁桃体样36份；采集公猪血样22份、母猪血样36份、后备猪血样24份、仔猪血样20份，冷链保存后送实验室检测。

1.1.1 主要仪器 Eppendorf移液器，Eppendorf离心机，DYY-8C型电泳仪，SUNRISE-BASIC型酶标仪，EDC-810型PCR扩增仪，Bio-RAD凝胶成像系统等。

1.1.2 主要试剂 猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产；猪瘟抗体ELISA检测试剂盒为IDEXX公司生产。根据GenBank收录的CSFV的E2基因设计特异性引物，由大连宝生物工程有限公司合成，扩增片段大小为272 bp。

1.2 检测方法

1.2.1 RT-PCR检测 取适量送检样品，置于碾钵中充分碾磨至糊状，加入灭菌生理盐水2～3 mL混匀后，取1.0 mL混合液至1.5 mL灭菌离心管中，置于超低温冰箱中反复冻融3次。严格按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书要求抽提病毒RNA，并按反应体系要求进行RT-PCR扩增，待反应结束后取产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果。

1.2.2 基因测序分析 对CSFV E2基因阳性条带明显的 10#、14#、18#、27#、33# 样品 RT-PCR 扩增产物，送武汉擎科生物技术有限公司测序。从GenBank数据库中搜集其他CSFV参考毒株的E2基因，对比本试验测序毒株与其他参考毒株同源性，分析所测得序列与其他毒株的遗传进化关系。

1.2.3 抗体检测 采用猪瘟抗体ELISA检测试剂盒对102份血清样品进行检测，严格参照试剂盒使用说明进行检测和判定。样品猪瘟抗体判定标准：阻断率≥40%为阳性，阻断率≤30%为阴性，30%＜阻断率＜40%为可疑。并对检测数据计算和分析抗体的离散度、平均值。

2 结果与分析

2.1 猪瘟病原RT-PCR检测结果

猪瘟病原套式RT-PCR方法扩增CSFV E2基因扩增产物电泳结果见图1。检测结果显示，36份样品中有 10#、14#、18#、27#、33# 等 5 份扩增出 E2 基因272 bp的片段，CSFV核酸阳性比例为13.9%。可能存在野毒感染，须进一步基因测序甄别。

图1 CSFV RT-PCR扩增产物

2.2 CSFV核酸基因测序分析结果

取5份核酸阳性样品CSFV E2基因扩增产物测序，分别得到序列134 HBWH-1/2018.9.28、135 HBWH-2/2018.9.28、136 HBWH-3/2018.9.28、137 HBWH-4/2018.9.28、138 HBWH-5/2018.9.28，与NCBI GenBank数据库不同参考株E2片段进行比对，猪瘟E2基因系统进化树分析结果见图2。结果表明：10号、27号和33号母猪CSFV核酸阳性属猪瘟野毒感染，均为猪瘟病毒2.1c亚型，与当前猪瘟疫苗毒株在不同分支；14号和18号母猪CSFV核酸阳性与疫苗毒株在同一分支，为猪瘟疫苗毒。

图2 CSFV E2基因遗传进化树分析

2.3 猪瘟抗体检测结果

猪瘟抗体检测结果见表1，种公猪和后备猪猪瘟抗体阳性率为100%，种母猪猪瘟抗体阳性率为91.70%，表明种猪群猪瘟免疫效果理想。仔猪猪瘟抗体阳性率为80%，抗体平均值为54，表明仔猪猪瘟抗体阳性率较好，但抗体离散度达到46%，仔猪抗体参差不齐，有被野毒感染的风险，需筛查原因，有必要进一步监测仔猪母源抗体水平变化，优化免疫程序，进一步提高其抗体整齐度。

表1 猪瘟抗体检测结果

3 讨论

（1）种猪群抗体阳性率达91.7%，高于国家猪瘟强制免疫抗体合格率70%，抗体平均值76，离散度23%，表明种猪群免疫程序合理。但仔猪猪瘟抗体阳性率虽达80%，但离散度也达46%，抗体水平参差不齐。仔猪猪瘟抗体离散度较大的原因可能源于未监测仔猪母源抗体水平变化，盲目套用免疫程序；也可能源于猪瘟野毒感染母猪，经胎盘垂直感染给胎儿或感染仔猪水平传播，免疫时出现免疫耐受，造成免疫失败。

（2）CSFV核酸阳性检测率13.9%，经监测其中60%为野毒、40%为疫苗毒。3例猪瘟野毒毒株与郭锐等报道2.1c毒株已经成为湖北地区流行毒株相一致[5]。但检出3头猪瘟野毒感染母猪临床上未表现猪瘟症状，以隐性感染存在，持续带毒，须及时淘汰。实践中仅根据RT-PCR检测结果淘汰阳性猪，易误淘汰疫苗带毒猪。2头猪瘟疫苗毒个体主要原因是采样与猪瘟疫苗免疫时间间隔21 d，猪瘟病原检测应在免疫30 d后进行。

（3）病原和抗体检测相结合的猪瘟净化方式，有利于提高淘汰野毒感染猪的效率。对检出的猪瘟抗体阴性猪强化免疫，及时补打猪瘟疫苗，30 d后再次检测抗体，仍为阴性者，直接淘汰。这样通过提高猪群猪瘟抗体水平，可提高猪场母猪繁殖性能和小猪生长性能[6]。