痛泻要方对内脏高敏性肠易激综合征大鼠模型作用及机制

李 聪

辽宁中医药大学附属第三医院 大肠外科，辽宁 沈阳 110003

肠易激综合征(irritable bowelsyndrome，IBS)以腹痛、腹部不适及排便异常为主要临床表现，其生物学机制尚不明确[1]。其发病机制中，以内脏高敏感性较为重要，即结肠组织对机械性刺激而产生的痛阈值下降，结肠及躯体出现痛觉过敏，也是IBS各种症状产生的病理基础。痛泻要方主治脾虚肝旺之泄泻。中医认为，痛泻之病主责于肝，肝失疏泄而致肝木抑郁，肝病传脾，木旺土虚，脾虚则发为泄泻，故临床常用痛泻要方治疗IBS。现代研究指出，IBS导致的内脏高敏与多种外周神经生物学机制相关，如胃肠道中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管活性肠肽、生长抑素等胃肠肽表达变化时[2]，会导致消化道内的过敏介质作用于神经终端，内脏痛阈值下降，对疼痛反应敏感。5-羟色胺4(5-hydroxytryptamine 4，5-HT4)受体为5-HT自身抑制性受体，可调节消化道5-HT水平，影响肠道各种感觉功能[3-4]。5-HT通过与胃肠道平滑肌上皮细胞中的5-HT4受体结合来调节胃肠道，包括促进胃肠运动、增加内脏敏感性、促进内脏分泌液体而抑制液体吸收。细胞癌基因fos(cellular oncogene fos，c-fos)为神经元激活的标志物，生理状态下表达不显著；病理状态下，各种外界刺激导致感觉神经元活化，c-fos表现为快速高表达[5-6]。在IBS状态下，内脏高敏性导致腹痛及腹部不适时，c-fos处于高表达水平[7]。本研究通过建立内脏高敏性大鼠，观察痛泻要方对IBS内脏高敏状态下结肠病理学改变及结肠组织中5-HT4受体、c-fos表达的影响，探讨痛泻要方治疗IBS内脏高敏性疗效机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取无特定病原体级Wistar大鼠60只[北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证书号：SCXK(京)2016-0002]，性别不限，出生8 d，体质量(11±2)g。将大鼠随机分为正常组(n=15)与模型组[模空组(n=15)、阳性对照组(n=15)及治疗组(n=15)]。

1.2 药物与试剂 痛泻要方中白术、白芍、陈皮、防风购自辽宁中医药大学附属第三医院中药房；匹维溴铵片(法国Mylan Laboratories SAS，批号：H20150632)；大鼠5-HT4、c-fos试剂盒(上海联硕圣物科技有限公司，批号：201607)； PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，批号：BK136BJ352)；Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR®Green QPCR Master Mix(Agilent Technologies，批号：0006124742)。

1.3 实验仪器 血管成形术球囊(美国mega公司，cp1637)；儿童导尿管(沈阳市普斯曼医疗器械有限公司，P204Fr)；旋转蒸发仪(郑州瑞涵仪器有限公司，RE52CS-2)；光学显微镜(Olympus公司，BX60)；CMIAS系列数码医学图像分析系统(麦克奥迪Med 6.0)；聚合酶链反应扩增仪(Singapore，2700PE)；电泳仪(北京仪器厂，DYY-8B)；核酸分析仪(BECKMAN Du 640)。

1.4 研究方法

1.4.1 模型制备 内脏高敏性IBS大鼠模型采用直肠扩张刺激法联合乳鼠与母鼠短暂分离法建立[8]。母鼠与乳鼠在饲养笼中适应性喂养7 d。第8天将15 mm球囊插入乳鼠直肠中，逐渐向球囊内注水以扩张肠道，2次/d，每次持续1 min，持续5 d。第13天改用20 mm球囊进行直肠扩张，持续5 d。第18天开始改用儿童导尿管扩张直肠，持续4 d。每日乳鼠直肠扩张后，单独放入其他笼内，与母鼠分离1 h，之后再与母鼠同放笼内。造模结束第2周、第4周以腹部撤离反射法进行肠道敏感性评估，证实乳鼠内脏高敏性形成。

1.4.2 给药方法 正常组、模空组给予0.9%氯化钠溶液10 ml/kg灌胃，1次/d；阳性对照组给予匹维溴铵混悬液13.5×10-3g/kg灌胃，1次/d；治疗组给予痛泻要方水煎液2.03 g/kg灌胃，1次/d。各组均给药2周。

1.5 观察指标 给药2周后，禁食24 h，以10%水合氯醛溶液麻醉，开腹，剪取2 cm结肠，以0.9%氯化钠溶液冲洗结肠组织。采用HE染色法观察结肠组织病理学改变；实时荧光定量聚合酶链反应检测结肠5-HT4受体、c-fos的mRNA表达水平，步骤参照Trizol试剂说明书；酶联免疫吸附法测定5-HT4受体、c-fos的蛋白表达情况，步骤参照酶联免疫吸附法试剂盒说明书。Primer-BLAST设计引物见表1。

表1 5-HT4受体、c-fos基因引物序列

2 结果

2.1 结肠组织病理结果 各组大鼠结肠黏膜上皮组织呈单层柱状，结肠黏膜腺体形态及大小未见明显异常，未见明显糜烂或溃疡。与正常组比较，模空组黏膜间质中出现少量炎性浸润，浆膜层可见轻度水肿，炎性细胞增多；与模空组比较，治疗组大鼠结肠黏膜间质内炎性细胞浸润减少，而浆膜层中未见明显水肿，炎性细胞减少。见图1。

图1 结肠组织病理结果(HE染色×100；a.正常组；b.模空组；c.阳性对照组；d.治疗组)

2.2 结肠组织5-HT4受体、c-fos mRNA表达情况 与正常组比较，模空组、阳性对照组及治疗组结肠组织5-HT4受体mRNA表达明显下降，c-fos mRNA表达明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与模空组比较，阳性对照组、治疗组结肠组织5-HT4受体mRNA表达明显上升，c-fos mRNA表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 结肠组织5-HT4受体、c-fos mRNA表达情况

注：与正常组比较，①P<0.05；与模空组比较，②P<0.05

2.3 结肠组织5-HT4受体、c-fos蛋白表达情况 与正常组比较，模空组、阳性对照组及治疗组结肠组织5-HT4受体蛋白活性表达明显下降，c-fos蛋白活性表达明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。与模空组比较，阳性对照组、治疗组结肠中5-HT4受体蛋白表达明显上升，c-fos蛋白的表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 结肠组织5-HT4受体、c-fos蛋白表达情况

注：与正常组比较，①P<0.05；与模空组比较，②P<0.05

3 讨论

痛泻要方为治疗消化系统疾病常用方，临床用于治疗急慢性IBS、慢性过敏性结肠炎、溃疡性结肠炎等。中医学认为，内脏高敏性IBS主责于肝旺脾虚，其病机为肝失疏泄，肝旺则乘脾，脾土受制于肝木，脾失健运而致泄泻。而由肝失疏泄引起的腹痛与现代医学所指内脏高敏性相仿，故治宜健脾柔肝。

内脏高敏性主要表现为痛觉过敏或痛觉超敏，机体各部位痛阈值明显下降，对生理或病理刺激均会产生不适感或强烈反应，进而导致痛阈值逐步降低，形成内脏-躯体相关性牵涉痛。有研究报道，引起IBS腹痛、腹部不适或排便异常的“元凶”是内脏高敏性[9]。而外周神经也在IBS内脏高敏性状态中发挥着调控作用。研究报道，消化道黏膜因各种刺激导致的损伤会释放出各种过敏介质，作用于初级传入神经纤维而致神经高敏状态，导致肠道外周神经的伤害感受器对管腔内牵拉等反射增强，降低机体痛阈值[10]。IBS为功能性肠道疾病，肠道内无明显病理学改变，目前，多采用内脏高敏感性动物模型来研究IBS发病机制及相关药物治疗机理[11]。

消化道中5-HT的代谢循环过程受多种因素调控，如脏器缺血、血管扩张、应激反应等生理、病理因素，也受胃肠道内自身受体的调控。消化道内黏膜分布多种5-HT受体，用以调节兴奋性与抑制性神经传导物质的传递，对胃肠道功能起到调控作用。研究发现，5-HT在IBS内脏高敏性病程进展中起着重要作用，而5-HT必须与相应的受体结合方可发挥其生物学作用[12]。5-HT4受体是一种G蛋白偶联受体，同时，也是5-HT的自身抑制性受体。当肠道中的5-HT释放后，会与5-HT4受体结合，导致感觉神经末梢去极化，进而使机体感受疼痛感，同时，5-HT激活后会诱导胃肠道的分泌与运动，参与肠道感觉[13]。5-HT4受体通过影响消化道黏膜释放5-HT可能是内脏高敏性调控机制之一。

有研究报道，痛泻要方能够通过调控IBS内脏高敏性大鼠血清及结肠中的5-HT及5-HT4受体表达进而降低内脏高敏性[14]。本研究结果表明，模型大鼠通过直肠扩张刺激及心理应激后，肠道敏感性增强，结肠组织中5-HT4受体基因及蛋白活性表达显著降低，促进胃肠道释放5-HT，同时，抑制5-HT4受体与5-HT的结合，进一步内脏敏感性增高。痛泻要方可显著降低肠道敏感性，上调大鼠结肠中5-HT4受体基因及蛋白活性表达。

c-fos属于早期即刻基因，主要作用于维持细胞功能、促进细胞增殖分化等。c-fos在生理状态下表达不活跃，当感受到外界刺激后，能短暂而迅速的提高表达，常用来检测激活的神经细胞。c-fos主要存在于与痛觉传输相关的神经元细胞核内部，故本研究以c-fos作为效应指标，观察内脏高敏性IBS时，外周神经与内脏痛觉敏感调节机制的关系。本研究结果表明，模型大鼠结肠组织中c-fos基因及蛋白表达明显上升，提示结肠神经丛细胞处于兴奋状态，对造模过程中产生的刺激做出反应，说明c-fos可作为有效的靶点来治疗应激性损伤或调节心理应激状态。痛泻要方可明显下调结肠中c-fos表达，可通过调控结肠黏膜中c-fos表达而降低内脏高敏性，降低痛觉应激反应。

综上所述，IBS内脏高敏性模型大鼠肠道敏感性增强，结肠中5-HT4受体表达下降，肠神经丛神经元中c-fos表达增高，可能是导致IBS内脏高敏性的发病机制之一。痛泻要方可通过调节结肠神经元、5-HT4水平，并通过调控结肠组织中c-fos表达调控内脏痛觉应激反应及抗应激损伤，从整体上起到疏肝止痛、健脾止泻之功。