慢病毒介导的FOXJ1过表达对胃腺癌细胞凋亡及线粒体膜电位的影响

张世甲，李 剑，韩广森

郑州大学附属肿瘤医院普外科 郑州 450008

胃癌是一种世界范围内的恶性肿瘤。胃腺癌是由胃腺体细胞恶性转化形成，发病机制涉及一系列基因的调控作用，这些基因可以影响细胞的多种生物学特性[1-2]。叉头框转录因子J1(forkhead box J1，FOXJ1)是FOX转录因子家族成员，参与纤毛形成、胚胎发育、自身免疫等过程。FOXJ1在不同肿瘤组织中的作用不同，其在肝癌中可能发挥促癌作用，而在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中可能发挥抑癌作用[3-6]。目前的研究[7-8]显示，FOXJ1在胃癌组织中表达减弱，上调其表达可以降低胃癌细胞转移潜能。本研究探讨了过表达FOXJ1对胃腺癌细胞凋亡的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂FOXJ1过表达慢病毒(Lv-FOXJ1)和阴性对照慢病毒(Lv-NC)由赛业(苏州)生物科技有限公司构建；胃腺癌细胞SGC-7901购自美国ATCC；Frist Strand cDNA Synthesis购自美国Thermo Fisher公司；SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自大连TaKaRa；引物由金斯瑞生物科技有限公司设计并合成；激活型Caspase-3(C-Caspase-3)抗体、细胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)抗体、激活型Caspase-9(C-Caspase-9)抗体购自北京百奥莱博科技有限公司；JC-1法线粒体膜电位检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2实验分组将SGC-7901细胞接种到24孔培养板，37 ℃条件下常规培养过夜，细胞融合度达30%左右开始慢病毒感染。用Opti-MEM稀释病毒液(MOI=50)，将病毒液添加到细胞中，同时加入Polybrene(终浓度为5 μg/mL)，混合，37 ℃条件下培养24 h，吸弃培养液，加入体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养72 h，用4 μg/mL嘌呤霉素筛选10 d，收集细胞。稳定感染Lv-FOXJ1和Lv-NC的SGC-7901细胞记为FOXJ1组和阴性对照组，设置不感染慢病毒的SGC-7901细胞为空白对照组。

1.3细胞中FOXJ1mRNA的检测取各组细胞，添加Trizol(每个6孔板内加入1 mL)，冰上静置5 min，按照RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，用First Strand cDNA Synthesis试剂盒合成cDNA，根据SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明进行Real-time PCR。反应条件：95 ℃预变性30 s(1个循环)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。引物序列：FOXJ1-F为5’-TGGATCACGGACAACTTCTGC TA-3’，FOXJ1-R为5’-CACTTGTTCAGAGACAGGT TGTGG-3’；内参β-actin-F为5’-GAGCTACGAGCT GCCTGACG-3’，β-actin-R为5’-CCTAGAAG CATTTGCGGTGG-3’。用2-ΔΔCt法计算FOXJ1 mRNA表达水平。实验重复3次。

1.4细胞中FOXJ1蛋白的Westernblot法检测取各组细胞，添加含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液于冰上裂解，用Bradford法检测蛋白浓度。在蛋白样品中添加5×上样缓冲液，98 ℃加热10 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min，-20 ℃保存。配制100 g/L积层胶和8 g/L分离胶，每个泳道上样50 μg，100 V电压电泳，直至溴酚蓝进入到凝胶底部。用半干法将凝胶上的蛋白转移到NC膜上(25 mA，转膜30 min)，将NC膜放在50 g/L脱脂奶粉中室温封闭2 h，加鼠抗人FOXJ1抗体(1∶600)、鼠抗人β-actin抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，加HRP标记的山羊抗鼠二抗(1∶2 000)在室温孵育1 h，ECL显色。内参为β-actin。以目的蛋白和内参条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。实验重复3次。

1.5细胞存活率的检测取各组细胞种植到96孔板，每孔5×103个细胞，培养2 d以后取出培养板，每孔加20 μL的MTT培养4 h。吸弃孔内液体，加150 μL的DMSO于摇床上振荡反应10 min。用酶标仪比色，参比波长为490 nm。设置空白孔调零。实验重复3次。

1.6克隆形成能力的检测取各组细胞接种在10 mL的培养皿中，每皿200个细胞，37 ℃培养箱内培养，14 d可观察到细胞克隆出现。多聚甲醛固定后，吉姆萨染色20 min，室温条件下干燥，计数细胞数≥50个的克隆数目，以克隆数目与接种细胞数目的百分比表示克隆形成率。实验重复3次。

1.7细胞凋亡率的检测取各组细胞，用4 ℃预冷后的PBS洗涤2次，加400 μL结合缓冲液，再加5 μL PI、5 μL Annexin V-FITC，避光条件下孵育20 min，上流式细胞仪检测凋亡率。实验重复3次。

1.8胞浆中CytC和细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白的检测取各组细胞，提取胞浆中的总蛋白，用Western blot法检测Cyt C蛋白水平，同时用Western blot方法检测细胞总蛋白中C-Caspase-3、C-Caspase-9水平；C-Caspase-3、C-Caspase-9抗体均以1∶600稀释，步骤同1.4。实验重复3次。

1.9线粒体膜电位的JC-1法检测取各组细胞配制成单细胞悬液，用PBS重悬3次，加JC-1染色液于37 ℃培养箱中孵育20 min，用冰预冷的JC-1染色缓冲液洗涤2次，添加1 mL的DMEM，上流式细胞仪检测。正常细胞中JC-1聚集在线粒体中产生红色荧光，凋亡细胞内JC-1以单体的形式聚集在胞浆中，产生绿色荧光。计算红色荧光和绿色荧光的比值，以此比值作为线粒体膜电位水平。实验重复3次。

1.10统计学处理实验数据用SPSS 21.0分析，3组细胞上述各指标的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组细胞中FOXJ1表达水平的比较FOXJ1组细胞中FOXJ1 mRNA和蛋白表达水平均高于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)。见图1和表1。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：FOXJ1组

组别nFOXJ1 mRNAFOXJ1蛋白空白对照组31.00±0.080.21±0.02阴性对照组30.98±0.130.20±0.06FOXJ1组31.96±0.23∗0.38±0.04∗F37.05516.446P<0.0010.004

*：与空白对照组、阴性对照组比较，P<0.05

2.2 3组细胞存活率和克隆形成率的比较FOXJ1组细胞存活率和克隆形成率低于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)。见表2。

表2 3组细胞存活率和克隆形成率的比较

*：与空白对照组、阴性对照组比较，P<0.05

2.3 3组细胞凋亡率和C-Caspase-3、C-Caspase-9表达水平的比较FOXJ1组细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9表达水平和细胞凋亡率高于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)。见图2和表3。

2.4 3组细胞线粒体膜电位及胞浆中CytC表达水平的比较FOXJ1组细胞线粒体膜电位低于空白对照组、阴性对照组，胞浆中Cyt C蛋白水平高于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)。见图3和表4。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：FOXJ1组

组别nC-Caspase-3C-Caspase-9细胞凋亡率/%空白对照组30.13±0.020.19±0.023.99±0.35阴性对照组30.12±0.050.20±0.044.12±0.47FOXJ1组30.35±0.04∗0.32±0.03∗24.58±3.76∗F33.80016.24187.278P<0.0010.004<0.001

*：与空白对照组、阴性对照组比较，P<0.05

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：FOXJ1组

*：与空白对照组、阴性对照组比较，P<0.05

3 讨论

FOXJ1基因定位于染色体17q22～q25，属于FOX转录因子家族成员。FOXJ1蛋白由403个氨基酸组成，含有转录激活域、核定位序列、DNA结合域。当受到多种细胞因子、生长因子等外界信号刺激时，细胞内的FOXJ1被激活，与靶基因上的KTTT GTTGTTKTW或者HWDTGTTTGTTTA序列结合(其中W表示A或T，H为非G，D为非C，K表示G或者T)，从而影响靶基因的转录，目前对于FOXJ1调控转录的具体机制尚不明确[9-11]。FOXJ1具有多种功能，参与免疫细胞如T细胞活化等过程，参与细胞内炎症因子、黏附分子、趋化分子等的表达调控，在脊椎动物纤毛、胚胎发育、神经系统分化等过程中发挥关键作用[12-14]。研究[4-5,15]证实FOXJ1参与肿瘤的发生，在不同肿瘤中发挥的作用不同；目前在人类乳腺癌细胞中发现FOXJ1基因异常高甲基化，而在肝癌细胞中FOXJ1表达水平升高。

最近的研究[7-8,16]显示，FOXJ1在胃癌组织中表达下调，在胃癌发生发展中可能发挥抑癌作用；上调胃癌细胞中FOXJ1的表达后，胃癌细胞的运动、迁移和侵袭能力降低，胃癌细胞分解细胞外基质的能力也下降。本实验结果表明，过表达FOXJ1的胃腺癌细胞凋亡率升高，同时细胞克隆形成能力和存活能力降低，提示过表达FOXJ1具有抑制胃腺癌细胞生长并诱导凋亡的作用，其在胃癌中发挥抑癌作用。

细胞凋亡是一个主动过程，其发生机制主要有内质网途径、线粒体途径、死亡受体途径等，线粒体途径是最为经典的细胞凋亡机制。线粒体释放Cyt C和线粒体外膜通透性增加是线粒体途径凋亡发生的关键。线粒体膜上的通透性转换孔开放可导致线粒体膜电位下降，存在于线粒体内的Cyt C可进入到胞质中。Cyt C具有激活Caspase-9的作用。Caspase-9是Caspase凋亡反应的上游因子，其活化可以迅速激活Caspase级联反应，最终激活位于凋亡反应下游的Caspase-3，诱导细胞凋亡发生[17-19]。Caspase-3和Caspase-9在正常细胞中以没有活性的酶原形式存在，C-Caspase-3、C-Caspase-9分别是Caspase-3和Caspase-9的活化形式，二者是细胞凋亡发生的直接参与因子[20-21]。本实验结果表明，过表达FOXJ1的胃腺癌细胞线粒体膜电位下降，同时细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9水平升高，胞浆中Cyt C蛋白水平升高，提示FOXJ1可能通过激活线粒体途径诱导Caspase凋亡反应，从而促进胃腺癌细胞凋亡。

综上所述，高表达FOXJ1可以抑制胃腺癌细胞的生长，诱导其凋亡，凋亡诱导机制与线粒体途径有关。这对于研究FOXJ1在肿瘤发生中的具体机制，对于阐明胃腺癌的发病机制具有重要意义。