基于微流控芯片的细胞外囊泡分离技术研究进展

廖泽荣, 李永瑞, 古 乐, 雷润宏, 苗云飞, 蓝鸿颖, 邓玉林, 耿利娜*

(1. 北京理工大学, 北京 100081; 2. 北京京东方传感技术有限公司, 北京 100176; 3. 北京大学第三医院肿瘤放疗科, 北京 100191)

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是脂质双分子层包绕形成的半球状囊泡,由细胞释放到细胞外环境,存在于血液、唾液、羊水、母乳和尿液等体液中。这些囊泡通常含有来自分泌细胞的细胞溶胶以及含量较高的细胞骨架蛋白和热休克蛋白[1],表面覆盖着整合素、糖蛋白和跨膜蛋白,这些蛋白质参与了囊泡运输[2]。根据不同的形成机制和生理特征,EVs主要可以分为3大类,外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体形成始于细胞内吞凹陷,以一种向内“萌芽”形成多泡内含体,与细胞膜融合后释放其中的小囊泡;而微囊泡是母体向外“萌芽”脱落形成;凋亡小体是细胞程序性坏死或者凋亡晚期释放的一种微囊泡。3种EVs不仅来源不同,大小也不同,外泌体的直径在30～100 nm,微囊泡为100～1 000 nm,而凋亡小体大约500～4 000 nm[3]。但上面的分类并不绝对,据报道外泌体也可以达到250 nm的尺寸,一些被认为是外泌体特有的标志物同样可以在非外泌体的囊泡上被发现[4]。EVs起初被认为是细胞排出的废物,但越来越多的研究表明,EVs存在重要的生物学功能,不仅参与细胞间的物质和信息传递,而且在细胞迁移、血管新生、免疫反应以及肿瘤浸润和转移等生理和病理过程中都发挥着重要作用[2,5-7]。故EVs的研究将有助于理解其生物学功能和作用机制,进而推动外泌体在癌症防御[8]、 再生医学[9]和药物传递[10]等疾病治疗以及癌症等疾病诊断[11,12]中发挥重要作用。近些年,围绕外泌体的EVs研究报道正在迅猛增长,基于外泌体的液体活检产品已在美国销售上市,比如分析血液中外泌体RNA检测非小细胞肺癌,ExoDx Lung(ALK)可以基于血浆外泌体准确检测非小细胞肺癌患者的EML4-ALK突变,在体液活检中应用的临床转化速度这一方面反映了对EVs的关注热度。

表 1 根据筛分机理分类Table 1 Classification by separation mechanism

然而,EVs的分离仍然是目前限制EVs相关研究和应用的瓶颈问题。由于体液特别是血样的成分复杂,实现EVs高效快速分离仍然具有很大挑战,成为难点和热点[13]。EVs分离的方法有超速离心、凝胶排阻层析、过滤、沉淀、免疫磁珠和微流控芯片等。其中基于尺寸、密度和表面电荷等物理特性进行分离的超速离心、凝胶排阻层析、过滤等传统方法存在通量低、繁琐、没有标准化方法、回收率低和纯度低的问题[14]。而采用沉淀分离方法和免疫磁珠[15-18]的商业化试剂盒存在容易发生非外泌体材料污染的问题[3],且上述方法都更多地需要手工操作,通量和回收率低,容易造成外泌体变形和污染,因此不适合大多数科研和临床应用场合。

将EVs从复杂的生物环境中高效分离出来,并保持EVs的结构和组成完整,是任何涉及EVs及其相关过程(如疾病标志物和药物输送)科学研究的关键步骤[3]。微流控芯片技术不仅具有微型化和自动化的特点,而且具有能够实现EVs的高效分离富集、下游EVs的操作处理、内含物解析的整合以及可高通量并行操作等集成化特性,因此具有得天独厚的优势。Chen等[19]首先将微流控芯片应用于EVs的分离,近年来基于EVs分离[15,17,20,21]和分析[22-24]的微流控肿瘤体外诊断液体活检技术受到较多关注。

本文对基于微流控芯片的EVs分离方法的研究进展进行了调研和总结。微流控芯片EVs分离方法可以从主动和被动的角度进行分类,被动方法包括基于抗体等的表面结合捕捉技术、基于多孔膜的筛分技术以及基于筛分结构的捕集技术,而主动方法包括基于光学可极化特性的光镊方法、超声共振分离手段、介电电泳、电泳、流式分选以及磁分选[3]。如果从分离机制的角度,也可以将目前微流控芯片中EVs分离方法分为物理和生物两大类(见表1)。

1 物理分离技术

物理分离的机制主要是根据EVs的物理特性(如大小、变形性和流体力学特性等)的差异,通过在芯片中设置包括微孔、微过滤网[25,26]和微柱等不同的微结构单元,以及利用惯性力和侧向位移方法[20]、声纳米滤波系统[27]、电动浓缩技术[28]和浓差极化电泳[29]分离EVs。物理技术提供了无须标记或衍生化、仅凭芯片自身结构或者其他物理手段实现外泌体分离的手段。国内科学工作者开展了卓有成效的工作,包括中科院纳米中心课题组[30]利用微流控黏弹液流实现了外泌体的无场分离,清华大学课题组[31]采用介电泳方法分离外泌体,浙江大学课题组[25]采用双层过滤技术实现微流控芯片外泌体的分离和富集。

1.1 筛分分离

目前,微流控芯片内的筛分分离大体可以分为两类:一类是传统的过滤分离,即在微流控芯片通道内装载过滤网[23]从而实现外泌体分离;第二类是通过先进的微机电加工技术(MEMS)在微流控芯片通道内构建不同的筛分结构,相较于传统过滤分离,该方法依托各种的MEMS技术,更加灵活可控。

利用H-filter结构,基于EVs的大小和扩散系数差异进行的场流分离方法也被用于EVs的分离[32],但是由于EVs的尺寸分布范围广,该方法的尺寸分离分辨率较低[33]。而通过Top-down的方式在芯片通道内加工微柱阵列,利用EVs的尺寸和变形性不同,提高了EVs分离的选择性。Wang等[34]将多孔硅纳米线引入微柱阵列选择性捕获脂质体,以排除蛋白质分子等和更大颗粒物的影响,之后采用溶解纳米线的方法释放所捕获的脂质体。

1.2 确定性侧向位移技术

同样基于规则排列的纳米柱,Santana等[35]建立的确定性侧向位移方法(deterministic lateral displacement, DLD)是在微流体通道中根据被分离粒子的流体动力学差异在柱间获得不同的流动轨迹,小于阈值的小颗粒会以zigzag轨迹在柱间移动,而在柱间反复碰撞的大颗粒会以位移轨迹模式移动,进而实现分离。通过调整阵列的几何参数,或者整合使用多种规格阵列,该微流控策略可以控制不同大小颗粒的移动轨迹。文献[16]采用一种纳米尺度下的DLD阵列技术实现了20 nm外泌体与胶质物的分离。

1.3 声波技术

声波也可以用于EVs的分离,Lee等[36]利用声纳米滤波系统对EVs进行了基于尺寸的分离。该方法通过将一对数字交叉换能器(IDT)电极作为超声源,在通道内产生驻波面声波(SSAW),从而使大颗粒从中心线向通道壁附近的压力节点偏移,而小颗粒停留在中心线上。通过调整声场的频率、振幅以及流速可以实现不同尺寸颗粒的分离,而通过组合使用不同的声场,并优化排放位置可以进一步改进分离效果[22]。

1.4 流场-流分馏技术

Kang等[37]应用流场-流分馏(FlFFF)技术分离包括外泌体在内的亚细胞颗粒。所施加的外力为水动力,样品通过FlFFF在矩形微通道内实现分离。细胞匀浆样品组分由通道轴向迁移流携带至检测器,因为抛物形流中心的流速高于管壁附近,因此较小的颗粒相对于较大的颗粒在与交叉流方向相反的方向上扩散更快、移动更远,不同尺寸大小颗粒从而得以分离。

1.5 黏弹性微流控

最近Liu等[30]报道了另一种基于黏弹性微流控的无标签被动EVs分离方法,颗粒分离取决于黏弹性介质作用于不同粒径颗粒产生弹性升力的差异。使用稀释的聚(氧乙烯)(PEO)溶液作为黏弹性剪切流体,使EVs样品沿通道侧壁排列,优化通道几何形状、PEO浓度和流动条件对系统中的弹性升力进行微调,使大颗粒不断向通道中心线迁移,从中间的出口收集大颗粒,而小颗粒(<200 nm)则从两侧出口流出。使用该装置从未经处理的胎牛血清(FBS)和细胞培养基中提取外泌体,纯度和回收率分别达到90%和80%。

2 生物和化学分离技术

第二大类方法是利用不同外泌体表面的生物和化学特性差异分离外泌体,主要基于抗原/抗体、受体/配体等生物特异性识别。将抗体、适配体固定于微通道内的纳米磁珠表面[15,38-40],或者将上述生物活性物质固定在芯片通道内微纳结构[41]、微纳图案表面[42],利用纳米材料或者纳米结构的高比表面积增大生物亲和组分与外泌体表面蛋白的接触面积和接触机会。基于免疫的分离方法具有常规理化方法所不具备的高选择性优势,在临床检测和实验室研究中起到举足轻重的作用,但是生物抗体始终存在较难获得、价格昂贵、稳定性差、与抗原结合后不易洗脱和无法重复使用缺点,而且基于免疫等生物活性物质的分离技术始终受制于对EVs表面特性的有限了解,同时还存在获取相关蛋白质难度大等问题,因此影响了该方法的应用和普及,需要价廉、稳定和洗脱方便的抗体替代品引入微流控芯片。

3 综合分离技术

除了不断引入新的技术手段,也有报道组合使用已有的技术,减少对某一技术的依赖,克服单一技术的缺点,不断提升分离捕获效率。比如利用在芯片上加工微纳米筛分结构与免疫方法结合分离外泌体[13,40,43]。武汉大学课题组[44]则是在芯片内引入ZnO纳米线,利用基于纳米线的微孔筛分和免疫方法结合实现外泌体的分离。

在各种生物分离技术中,分子印迹技术模拟了抗原和抗体作用,是一种人工合成具有分子识别功能的新型高分子材料的技术。分子印迹可以针对不同模板“一对一”定制获得选择性和立体识别性,因其更加可靠耐用、易于化学合成,与生物抗体相比有很多优势而受到研究者们的青睐[45,46]。本课题组已将天然生物亲和元件-适配体与分子印迹技术相结合制备出具有更高生物亲和性和选择性的外泌体印迹材料。在此基础上,我们又将该材料引入微流控芯片构建外泌体捕获新方法[47]。

4 结论

细胞外囊泡是存在于体液中的小颗粒,内含复杂的蛋白质和核酸等成分,利用细胞外囊泡实现临床诊断、作为疾病治疗手段或者了解细胞内通讯已引起科学界越来越大的兴趣。但到目前为止,EVs的定义和表征尚不明确,缺乏标准化协议。有研究表明,EVs中的蛋白质成分会随着样品放置时间而发生几乎会被忽略的变化,说明样品分离和前处理方法的建立和标准化的重要和迫切性。微流控芯片具有微型化、自动化和集成化等优势,将分离以及各种分析技术引入微流控芯片,能够为细胞外囊泡捕获和解析提供一个高通量、高开放性和高稳定性的样本到结果(sample-to-result)平台,有望为基于细胞外囊泡的医学研究以及体液活检技术开辟一条新的道路。