采后苯并噻重氮处理对‘玉金香’甜瓜单萜类香气及其代谢关键酶的影响分析

王 雨，李霁昕，李经纬，郝兰兰，胡妍芸，王 博，蒋玉梅,*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃省葡萄酒产业技术研发中心，甘肃 兰州 730070；2.甘肃出入境检验检疫局综合技术中心，甘肃 兰州 730070）

‘玉金香’甜瓜是我国西北地区主要的经济作物之一，属于呼吸跃变型果实，采后极易被病原菌侵染而发生腐烂[1-2]。苯并噻重氮（benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester，BTH）是目前常用的一种典型的植物抗病诱导剂[3]，能够诱导甜瓜果实产生抗病性，有效降低甜瓜果实的采后腐烂率[4-5]。香气物质的组成和含量是衡量甜瓜品质的重要指标[6]，已有240多种香气物质被分离检测[7]，根据合成前体，其代谢途径可分为脂肪酸途径、氨基酸途径和碳水化合物途径[8]。目前研究显示采后BTH诱抗处理可提高甜瓜果肉和果皮组织的脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性，进而影响脂肪酸途径香气组分代谢[9]。同时，采后BTH处理会降低‘玉金香’果实氨基酸含量，抑制相关代谢酶活性，进而改变酯类香气组分的释放[10]。关于采后BTH处理对萜烯类香气代谢的影响分析及研究目前鲜见报道。

以碳水化合物为前体的萜烯类合成途径包括甲基磷酸赤藓糖途径（methyl-erythritol-4-phosphate pathway，MEP）和甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，MVA）[11]。单萜类香气物质以糖的中间代谢产物3-磷酸甘油醛、丙酮酸为前体，经MEP途径生成香叶基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP），再由单萜合成酶催化生成[12-13]，其中l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）是MEP代谢途径中的限速酶[14]。

本研究以厚皮甜瓜‘玉金香’为实验材料，监测采后常温贮藏期间单萜类香气组分及其代谢酶DXR活力的变化，分析其相关性，探讨采后BTH诱抗处理对DXR活力和单萜类香气形成的影响，以期为甜瓜果实香气代谢机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘玉金香’厚皮甜瓜，2017年6月（花后45 d）采自甘肃省皋兰县什川镇，果发泡网袋包装，36 个/箱，当天运抵实验室，室温（（22±2）℃、相对湿度55%～65%）贮藏。

BTH（纯度98%）、2-辛醇（色谱纯） 美国Sigma Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

TRACE1300GC-ISQ300气相色谱-质谱联用仪、TG-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.5 µm）、Genesis 10S型紫外-可见分光光度仪 美国Thermo Scientific公司；固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）装置、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅（divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-siloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国Surpelco公司；CP 214型电子分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司；PHS-3C pH计上海雷磁仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

1.3.1.1 BTH诱抗处理

参照Vieira dos Santos等[15]的方法并略作修改。于采收当日，选择成熟度、大小相近、无损伤和虫咬的果实，分别采用100 mg/L BTH溶液（蒸馏水配制，BTH处理组）、蒸馏水（CC组）浸泡10 min，以未处理果实为对照（CK组）。室温条件（（22±2）℃、相对湿度55%～65%）贮藏。

1.3.1.2 取样

参照Bi Yang等[16]的方法并略作修改。贮藏第0、2、4、6、8、l0、12、14天随机抽取外观相近、无损伤的‘玉金香’果实样品，每组10 个，分别取果实“赤道”附近的果皮组织（皮下2～5 mm）、果肉组织（皮下5～8 mm），切小块混匀，每3.0 g锡箔纸包裹液氮冷冻，-80 ℃保存用于测定酶活力；香气检测样品每5.0 g混匀的小块置于20 mL顶空瓶中，加入1.0 g NaCl、内标2-辛醇（8.82 mg/L）20 μL，密封混匀，-20 ℃保存待测。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 香气含量的测定

参照Zhang Bo等[17]的方法并修改。样品常温解冻，40 ℃下平衡30 min。插入活化的SPME装置，40 ℃顶空吸附30 min。GC进样口热解析10 min。

GC条件：进样口温度240 ℃，不分流进样，20 min后打开分流阀，分流比30∶1；升温程序：初温50 ℃，以3 ℃/min升至170 ℃，保持10 min；载气（He）流速1.0 mL/min。

MS条件：电子轰击离子源（electron impact ionization，EI）；电子能量70 eV；传输线温度180 ℃；离子源温度240 ℃；质谱扫描范围m/z 40～350。

1.3.2.2 酶活力的测定

DXR活力的测定参照Hasunuma等[18]的方法并略作修改。取低温保存样品3.0 g（冷冻状态）于-20 ℃预冷研钵，加6.0 mL提取液（含150 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L β-巯基乙醇、1 mmol/L二磷酸硫胺），冰浴条件下研磨匀浆，15 000×g、4 ℃离心15 min，取上清液，为粗酶液。反应混合液（含100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、1 mmol/L MnCl2、0.12 mmol/L NADPH、0.25 mmol/L DXP）3.0 mL，加入1 mL粗酶液，利用紫外-可见分光光度计测定340 nm波长处的吸光度，每隔20 s读数，连续测定3 min。以不含粗酶液的反应混合液为对照。酶活力单位为U/g，结果以鲜质量计。每个样品检测做3 次独立重复。

1.4 数据处理与分析

香气物质经计算机检索NIST Library（11）、Wiley Library，结合文献人工图谱解析定性，内标法半定量。采用Excel 2010软件对数据进行统计分析；采用SPSS 19.0软件进行相关性分析（相关系数法）。

2 结果与分析

2.1 不同处理对甜瓜果实贮藏过程中DXR活力的影响

图 1 BTH处理对贮藏过程中甜瓜DXR活力的影响Fig. 1 Effect of BTH treatment on DXR activity in muskmelon during storage

由图1A、B可知，采后贮藏期间果皮和果肉试样中DXR活力均呈单峰型变化，CK和CC组果皮和果肉试样活力峰值均在第6天出现，BTH处理可抑制DXR活力，并使高峰延迟2 d出现，条件因子水使DXR活力高峰值增加，贮藏第0～2天，CC组果皮和果肉试样DXR活力低于CK组，高于BTH处理组；第2～6天，CC组DXR活力急剧上升；贮藏的第10天，CC组的DXR活力比CK组低，CC组果皮和果肉试样DXR活力分别较CK组低3.41%和4.35%。贮藏期间CC组DXR果皮和果肉试样活力峰值分别为（4.11±0.14）、（1.81±0.05）U/g，BTH处理组果皮和果肉中DXR活力比CC组分别降低了19.48%和25.49%。果皮试样DXR活力整体高于果肉试样，CK、CC组和BTH处理组果皮试样DXR活力峰值较果肉试样分别高1.2、1.3、1.4 倍。由图1A可知，对于果皮，BTH处理组峰值为（3.48±0.11）U/g，分别比CK和CC组峰值低4.85%和15.15%。由图1B可知，对于果肉，BTH处理组峰值为（1.48±0.11）U/g，比CK和CC组低9.78%和18.23%。

前人报道‘玉金香’厚皮甜瓜贮藏期间乙烯释放规律为：常温贮藏期间CC组果实乙烯于第6天出现释放高峰，BTH处理后，乙烯释放高峰提前，释放量受到显著抑制[19]。结合分析发现，本实验CK和CC组果皮和果肉试样DXR活力达到峰值的时间与乙烯跃变的时间相一致，均出现在第6天，BTH处理后DXR活力也被抑制。由此推断，厚皮甜瓜‘玉金香’DXR活力与乙烯的释放存在一定的相关性，具体机理还有待进一步研究。

2.2 不同处理对甜瓜果实贮藏过程中单萜类香气释放量的影响

实验甜瓜果实共检出代谢自MEP途径的单萜类香气组分9 种。包括1 种无环单萜（香叶醇）、7 种单环单萜（α-萜品醇、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、L-香芹醇、对-薄荷-(7),8(10)-二烯-9-醇、反式-(+)-异柠檬烯、L-薄荷醇、水茴香醛）、1 种三环单萜（桉叶油醇）。

2.2.1 不同处理对甜瓜果实贮藏过程中无环单萜类香气物质释放量的影响

香叶醇在果皮和果肉样品中均呈双峰型变化，各样品峰值出现时间一致。BTH处理组香叶醇含量始终低于CK和CC组。由图2A可知，对于果皮，贮藏前期各处理组香叶醇的释放量均呈上升趋势，分别于第4天和第8天出现释放高峰。第8天CC组释放峰值为（0.432±0.037）ng/g，分别是CK组和BTH处理组的1.27 倍和1.59 倍。由图2B可知，对于果肉，香叶醇的释放量分别在第2天和第8天达到释放高峰。CK、CC组和BTH处理组第二次释放高峰值远远大于第一次释放高峰值，分别是第一次释放高峰值的4.00、3.58、6.03 倍。CK组和BTH处理组第8天释放峰值分别为（1.872±0.167）ng/g和（1.438±0.216）ng/g，分别是CC组的87.98%和67.57%。

图 2 BTH处理对贮藏过程中甜瓜MEP途径代谢无环单萜类香气物质释放量的影响Fig. 2 Effect of BTH treatment on release of aroma-active acyclic monoterpene compounds through methyl-erythritol-4-phosphate pathway from muskmelon during storage

2.2.2 不同处理对甜瓜果实贮藏过程中单环单萜类香气物质释放量的影响

实验甜瓜果实检测出单环单萜类香气α-萜品醇、L-香芹醇、对-薄荷-(7),8(10)-二烯-9-醇、L-薄荷醇和反式-(+)-异柠檬烯在样品贮藏期间呈双峰型变化，顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇CK组呈单峰型变化，CC组和BTH处理组呈双峰型变化，水茴香醛呈单峰型变化。

α-萜品醇在果肉样中的释放量是单萜类香气物质中最高的。由图3A1可知，对于果皮，CC组在第2天和第6天达到释放高峰，CK组和BTH处理组第0～2天急速下降，第4天和第10天达到峰值，两者变化趋势一致；CC组第6天释放峰值为（0.623±0.071）ng/g，分别是CK组和BTH处理组第二次（10 d）峰值的1.26 倍和1.70 倍。由图3A2可知，对于果肉，各处理组α-萜品醇的释放量均分别在第2天和第8天达到高峰，CK、CC组和BTH组第二次释放峰值分别是第一次释放峰值的5.61、4.21 倍和5.90 倍；BTH处理组释放量始终低于CC组，BTH处理组第8天释放峰值为（2.320±0.211）ng/g，分别是CK和CC组释放峰值的78.31%和70.55%。

顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇在果皮和果肉中释放规律不同。CC组和BTH处理组释放高峰出现在第2天和第6天，CK组第4天达到释放高峰。由图3B1可知，对于果皮，贮藏第6天CC组释放峰值为（0.347±0.043）ng/g，分别是CK组和BTH处理组第二次释放峰值的1.22 倍和1.43 倍。由图3B2可知，对于果肉，BTH处理组第二次释放峰值是第一次释放峰值的5.14 倍，BTH处理组第6天释放峰值为（0.890±0.143）ng/g，分别是CK组和CC组第二次释放峰值的81.52%和63.97%。

由图3C1可知，对于果皮，CC组L-香芹醇在第2天和第6天达到释放高峰，释放量明显高于CK组和BTH处理组，10 d后含量低于CK组，高于BTH处理组；CK组和BTH处理组第二次释放高峰较CC组推迟2 d出现；第6天CC组释放峰值为（0.580±0.056）ng/g，分别是CK组和BTH处理组第二次峰值的1.23、1.44 倍。由图3C2可知，对于果肉，CK组和BTH处理组变化趋势相一致，CC组8 d后含量低于CK组和BTH处理组，BTH处理组第8天释放峰值为（0.430±0.057）ng/g，分别是CK组和CC组第二次峰值的80.52%和62.41%。

对于果皮和果肉，CC组对-薄荷-(7),8(10)-二烯-9-醇第一次释放高峰均出现在第2天，含量低于CK组，高于BTH处理组，第二次释放高峰均出现在第6天。由图3D1可知，对于果皮，CK组和BTH处理组第二次释放峰值较CC组推迟2 d出现。第6天CC组释放峰值为（0.524±0.054）ng/g，分别是CK组和BTH处理组第二次释放峰值的1.19、1.50 倍；由图3D2可知，对于果肉，CC组和BTH处理组变化趋势相一致，BTH处理组第6天释放峰值为（1.280±0.172）ng/g，分别是CK组和CC组第二次释放峰值的90.67%和59.20%。

由图3E1可知，对于果皮，CC组L-薄荷醇在第2天和第6天达到释放高峰，CK组和BTH处理组在贮藏前2 d释放量呈下降趋势，第4天和第8天达到峰值，贮藏第10～14天，L-薄荷醇释放量再次升高；第6天CC组释放峰值为（1.214±0.173）ng/g，分别是CK组和BTH处理组第二次释放峰值的1.22、1.62 倍。由图3E2可知，对于果肉，BTH处理组第二次释放高峰较CK和CC组推迟2 d出现，BTH处理组第8天释放峰值为（0.787±0.145）ng/g，分别是CK和CC组第二次释放峰值的79.82%和55.19%（第6天）。

由图3F1可知，对于果皮，CK和CC组反式-(+)-异柠檬烯释放高峰均出现在第2天和第6天，BTH处理组第二次释放高峰较CC和CK组推迟2 d，贮藏第10～14天，反式-(+)-异柠檬烯释放量略有上升，第6天CC组释放峰值为（1.991±0.158）ng/g，分别是CK组和BTH处理组第二次峰值的1.15、1.59 倍。由图3F2可知，对于果肉，各处理组差异较大，BTH处理组第二次释放高峰较CC组推迟4 d出现，BTH处理组第10天释放峰值为（2.067±0.280）ng/g，分别是CK和CC组第二次释放峰值的82.31%和71.99%。

水茴香醛在果肉试样中未检出。由图3G1可知，对于果皮，CK组水茴香醛在第4天达到释放高峰，CC组和BTH处理组的释放高峰则出现在贮藏第6天，释放高峰后，样品释放量急剧下降，CC组释放峰值为（0.527±0.042）ng/g，分别是CK组和BTH处理组的1.14 倍和1.43 倍。

图 3 BTH处理对贮藏过程中甜瓜MEP途径代谢单环单萜类香气物质释放量的影响Fig. 3 Effect of BTH treatment on release of aroma-active monocyclic monoterpene compounds through the methyl-erythritol-4-phosphate pathway from muskmelon during storage

2.2.3 不同处理对甜瓜果实贮藏过程中三环单萜类香气物质释放量的影响

桉叶油醇在果皮样中未检测出，果肉样中呈单峰型变化。由图4可知，对于果肉，CC组贮藏第0天未检测出，之后急剧增加，第6天达到释放高峰，CK组和BTH处理组贮藏前2 d未检测出，之后缓慢上升，分别在第8天和第10天达到释放高峰。BTH处理组释放峰值为（1.069±0.198）ng/g，分别是CK组和CC组的69.40%和50.72%。

图 4 BTH处理对贮藏过程中甜瓜MEP途径代谢三环单萜类香气物质释放量的影响Fig. 4 Effect of BTH treatment on release of aroma-active tricyclic monoterpene compounds through the methyl-erythritol-4-phosphate pathway from muskmelon during storage

由此可见，BTH处理可抑制单萜类香气物质的释放，改变其释放峰值出现时间。条件因子水会促进释放高峰前单萜类香气物质的释放，8 d后则在一定程度上减少了单萜类香气物质的释放，但无明显作用规律。

2.3 甜瓜贮藏过程中DXR活力与单萜香气物质释放量相关性分析

由表1可知，CK组α-萜品醇含量与DXR活力呈负相关，其他8 种单萜类香气物质含量都与DXR活力呈正相关，香叶醇、反式-(+)-异柠檬烯、水茴香醛含量与DXR活力呈显著正相关（P＜0.05）。由表2可知，采后BTH处理，对L-薄荷醇、桉叶油醇含量与DXR活力相关性无影响；但会提高顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、L-香芹醇、对-薄荷-(7),8(10)-二烯-9-醇、水茴香醛含量与DXR活力的相关性；BTH处理组的α-萜品醇含量与DXR活力相关性由CK组的负相关变为正相关。反式-(+)-异柠檬烯含量与DXR活力的相关性则会被BTH处理减弱。

表 1 CK组DXR活力与单萜类香气物质释放量相关性Table 1 Correlation analysis of DXR activity with release of aroma-active monoterpenes from control samples

表 2 BTH处理组DXR活力与单萜类香气物质释放量相关性Table 2 Correlation analysis of DXR activity with release of aroma-active monoterpenes from BTH-treated samples

3 讨 论

本实验研究表明采后BTH处理可抑制‘玉金香’甜瓜DXR活力，延迟其活力峰值的出现，改变单萜类香气物质含量与DXR活力的相关性，进而影响单萜类香气的释放。已报道的研究显示糖代谢中的葡萄糖经糖酵解途径产生的产物3-磷酸甘油醛、丙酮酸及乙酰CoA是萜类物质合成的前体[20]。以3-磷酸甘油醛和丙酮酸为原料经MEP途径是单萜合成的最主要途径[21]。DXR是MEP途径中的关键限速催化酶[22]。DXR催化的反应是MEP途径中“碳流”的分支点，也是调控萜类化合物合成的有效靶点[23]。研究人员从薄荷中分离得到DXR基因，并将DXR基因连接CaMV 35S启动子转移到薄荷中，大多数转基因植株的薄荷精油（多为单萜化合物）含量与对照相比增高，最高增幅可达50%[24]。姜花萜类代谢途径以MEP途径为主，经磷甘霉素（可抑制MEP途径中DXR活力）处理后，姜花萜类挥发性香气物质含量与对照相比降低了90%以上[25]。这些报道佐证了本实验的推断，采后BTH处理可通过抑制MEP途径DXR活力，进而影响厚皮甜瓜‘玉金香’的单萜类香气的生成和释放。

从感官品质的角度分析，单萜类香气大都带有浓郁的果香、花香和木香[26-27]，如香叶醇具有橙子花香味[28]；α-萜品醇具有带甜的浓青香和木青香[29]；反式-(+)-异柠檬烯具有令人愉快的柠檬香气[30]，采后BTH处理减少了该类物质的释放，进而会减弱样品甜瓜甜香和花香感，影响其香气品质，这与消费者对BTH处理甜瓜样品的感官认知基本一致。

4 结 论

‘玉金香’甜瓜果皮和果肉中共检出9 种单萜类香气组分，其中8 种单萜类香气物质含量与DXR活力呈正相关；采后BTH处理在一定程度上抑制了甜瓜DXR活力和单萜类香气物质的释放，延迟了DXR活力峰值出现，改变了单萜类香气释放规律及其与DXR活力的相关性。由此可见，采后BTH处理可通过抑制‘玉金香’甜瓜DXR活力，延迟活力峰值的出现，改变单萜类香气与DXR活力的相关性，进而影响单萜类香气的释放。条件因子水对DXR活力及其产物单萜类香气物质释放均有影响，但其作用规律和机理还有待进一步研究。