胆酸-黄芩苷脂质体的制备

谭裕君， 李 楠， 向 燕， 冯玲玲

（成都中医药大学药学院，四川成都611137）

黄芩苷是一种黄酮类化合物，为黄芩Scutellaria baicalensis Georgi有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用，尤其在抗炎方面更显著［1-2］；胆酸是一种甾体化合物，为多种动物胆汁的有效成分，具有解热、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒活性，可通过抑制血管通透性、肉芽肿来发挥其抗炎作用［3］。以上2种成分可协同抗炎［4］，但黄芩苷单独作用时由于其水溶性、脂溶性较差，口服生物利用度不高，从而限制了临床应用。

脂质体是一种类似双分子层微囊的结构，生物相容性良好，毒性低，包裹黄芩苷后可提高其稳定性与溶解度，具有良好的抗菌、抗炎作用［5］，但该剂型口服后在胃肠道内不稳定，而加入一定胆盐后可作为磷脂膜组成成分，抵抗胃肠道内胆盐进攻，从而增加药物稳定性［6］。胆酸是胆酸盐合成原料，也为去氧胆酸、牛黄胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸等成分的合成底物［6-7］，同时可作为辅料，增加胆固醇在人体内的吸收［8］及药物在肝实质细胞中的蓄积［9］。

“药辅合一”是中药制剂学独有理念，即在不影响主药疗效的基础上添加适宜辅料，使其既可发挥相应作用，又可增强主药疗效［10］，而胆酸正符合该思想。本实验将黄芩苷作为治疗结肠炎的主药，加入胆酸制备脂质体，并对其工艺进行优化。

1 材料

KQ-300VDB型双频数控超声仪 （昆山市超声仪器有限公司）；RE-3000型旋转蒸发器 （上海亚荣生化仪器厂）；UV-VIS-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；Zetasizer 3000型粒度测定仪（英国 Malvern公司）；FEI Tecnai Spirit Tem 120 kV透射电子显微镜 （美国FEI公司）；ZNCLBS 141∗140磁力搅拌器 （郑州华特仪器设备有限公司）。

在威远镇卓扎滩村建立马铃薯“下寨65”“青薯2号”“青薯9号”原种全程机械化作业示范区53.3 hm2，平均产量2.87×104kghm-2，总产量达152.97×104kg；实现收入3.44万元·hm-2，总产值183.56万元(按1.2元/kg计算)；与露地常规栽培平均产量3.05×104kghm-2、收入2.75万元·hm-2(按0.9元/kg计算)相比，增收0.69万元·hm-2，新增产值36.78万元·hm-2。

黄芩苷原料药 （含有量90%，南京泽朗生物科技有限公司）；无水胆酸原料药 （含有量98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大豆卵磷脂、胆固醇 （上海艾韦特医药科技有限公司）；黄芩苷对照品 （中国食品药品检定研究院）；透析袋（美国Viskase公司，分子截留量10 000）。三氯甲烷、乙醚均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷含有量测定

在这样的人生里，他遇到过数不清的形形色色的面孔，善良的，狡诈的，敦厚的，心机的，还有阴阳两面的，都无一例外在他的木偶戏里活脱脱地搬演过。他耍木偶耍得活灵活现，叫别人看得那么过瘾，而自己也正像木偶那样被生活中那些看不见的手摆弄过来摆弄过去，无论好坏都得受着。苦时“身上无衣又无盖，我冷冷清清，清清冷冷饿难挨”（《苏武牧羊》唱词），喜时“满园花儿齐开放，绿树荫浓细草长。”（《火焰驹·表花》唱词），人这一辈子啊，各种滋味都得尝都得受，虽然回头也不过是烟花一瞬，“哗”地就散了。

2.1.1 检测波长确定 精密称取适量黄芩苷，PBS（pH＝7.0）溶解，在200～400 nm波长下进行全波长扫描，再制备空白脂质体，适量甲醇稀释后进行光谱扫描。结果，黄芩苷在276 nm处有最大吸收峰，在315.5 nm处有相对较强的吸收峰；空白脂质体在276 nm处有吸收，造成干扰，故选择315.5 nm作为检测波长。

这是到金江市区的唯独一条县级干道。看来今天是插翅难逃了。看到摩托车穷追不舍，胖子叫司机靠边停车，掏出电话向何泽说明了情况。何泽说，你们停下周旋一下，若能出点钱意思一下过去也行，不行就先拉到林业站，然后他来想办法。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取黄芩苷对照品适量，PBS制成3 mg／mL溶液，即得。

道德与文化都是与人类共生存的，二者有着密切的关系。在当下大数据时代，文化建设面临多方面挑战，出现了一种逆道德、反道德思潮。一方面是文化领域里道德的缺失，主要表现为文化的物化趋向，出现了泛商品化、消费化等现象；另一方面由于世界各种文化的交汇，中国传统文化一定程度出现了消解，导致了绝对价值的遮蔽，使文化的发展缺失了主导性价值目标。加强文化与道德关系的研究特别是道德的文化价值，对于推进新时代先进文化建设，减少道德失范现象的出现，不仅具有理论意义，而且对于促进社会和谐有着一定的应用价值。

2.1.9 包封率、载药量测定［11-12］

2.1.5 精密度试验 取高、中、低质量浓度对照品溶液，在1 d内于315.5 nm波长处测定吸光度5次，测得日内精密度 RSD分别为 0.54%、0.91%、1.8%，表明该方法精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一脂质体6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于315.5 nm波长处测定吸光度，测得黄芩苷含有量RSD为1.7%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一脂质体，按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在0、1、2、4、6、8、10、12、14 h于315.5 nm波长处测定吸光度，测得其RSD为0.64%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取含有量已知的同一脂质体6份，精密加入对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于315.5 nm波长处测定吸光度，计算回收率。结果，黄芩苷平均加样回收率为96.53%，RSD为2.5%。

2.1.4 线性关系考察 将对照品溶液用PBS稀释成 2.936、 5.872、 8.808、 11.74、 14.68、 26.402 μg／mL，于315.5 nm波长处测定吸光度。以黄芩苷质量浓度为横坐标 （X），吸光度为纵坐标 （A）进行回归，得方程为 A＝0.040 1X＋0.012 4（r＝0.999 8）， 在 2.936～26.402 μg／mL 范围内线性关系良好。

全区3.6万余亩樱桃中，“黑珍珠”品种达到近3.35万亩，玛瑙红和黄灯笼2个品种仅占约7%，品种过于单一。如遇樱桃褐斑病和根癌病等绝对优势病害爆发性发生，危害较重，很难有效及时地进行防治，易造成绝收和植株死亡，会给种植户带来极大损失[3]。另外，由于品种结构过于单一，导致成熟期集中，市场供应品种单一，加之樱桃果实不耐贮藏，且成熟期温度较高，采后处理设施滞后，如果成熟期遇雨，极易造成采前裂果、烂果和落果，产量损失严重。这都将给种植户销售樱桃带来巨大压力，也严重限制乌当樱桃走出去的步伐。

2.1.9.1 包封率 吸取适量脂质体，装进提前处理好的透析袋 （分子截留量10 000）中，浸入装有200 mL pH 7.0 PBS的烧杯中，120 r／min透析7 h，取透析介质，于315.5 nm波长处测定吸光度，计算游离黄芩苷含有量 （W游）；另取适量脂质体，甲醇破乳后于315.5 nm波长处测定吸光度，计算黄芩苷总含有量 （W总），计算包封率，公式为包封率＝ （1－W游／W总） ×100%。

2.1.9.2 载药量 公式为载药量＝ ［（W总－W游）／W］×100%，其中 W为卵磷脂、胆固醇、胆酸、黄芩苷总质量）。

2.2 制备方法

有希望才有失望，有要求才有不尽人意。父母希望孩子成龙成凤，这是压力，也是父母强烈的爱意与自信：我相信我的基因我的教育，我一丝不苟养育出来的孩子，必定会发挥我的最优面。亲戚也是，他们从小听惯“这孩子聪明”的话，信以为真，自动给这句话加了后半句“就是不用心/就是懒/就是没睡醒”——但还是认定“这孩子聪明”。他们相信响鼓也需重槌，对晚辈说几句重话，是为了让晚辈警醒。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取0.5 mL脂质体，甲醇破乳定容稀释，即得。

2.2.1 薄膜分散法［13］将处方量大豆卵磷脂、胆固醇、胆酸、黄芩苷加入24 mL三氯甲烷与乙醚（1∶2）混合液中，搅拌至完全溶解，置于梨形烧瓶中，20℃水浴下旋转蒸发除去有机溶剂，使类脂在瓶壁形成一层均匀的薄膜，脂膜中加入适量pH 7.0 PBS水化，水浴超声使其分散，0.22 μm微孔滤膜过滤3次，整粒减小粒径。

闹太套：是英语“not at all”的谐音。黄晓明在演唱歌曲《One World One Dream》时，由于对“not at all”的发音酷似“闹太套”而遭网友调侃。

2.2.3 泡腾分散法［14］将处方量黄芩苷、吐温80、卵磷脂、柠檬酸、胆酸溶于10 mL乙醇中，0.22 μm疏水膜过滤，5～8℃下将滤液加到10 mL 0.35%碳酸氢钠溶液中，1 000 r／min搅拌 1 h，25℃下继续搅拌，直至变得不透明。

2.2.4 方法筛选 表1显示，逆向蒸发法所得脂质体包封率、载药量较高，故选择该方法。

表1 制备方法筛选结果Tab.1 Results of preparation methods screening

2.3 制备工艺优化

2.3.1.2 胆酸用量 固定其他因素，选择胆酸用量 3、 5、 10、 15、 20、 30 mg， 按 “2.2.2” 项下方法制备脂质体。结果，胆酸用量10 mg时脂质体包封率、载药量较高。

2.3.1 单因素试验

2.3.1.1 胆酸加入顺序 固定其他因素不变，分别将胆酸加到有机相、水相、有机相与水相的混合相中，按 “2.2.2”项下方法制备脂质体。结果，胆酸加到混合相中时脂质体包封率、载药量较高。

为了充分了解大学生的综合素质状况，我们从某“211工程”高校所属的5个学院中抽了20名学生进行综合素质测评。各个指标值按照关键控制点的要求计算，获得的评价矩阵见表1。

2.3.1.3 磷脂-药物比例 固定其他因素，选择磷脂-药物比例 3 ∶1、 7 ∶1、 11 ∶1、 15 ∶1、 20 ∶1，按 “2.2.2”项下方法制备脂质体。结果，两者比例15∶1时脂质体包封率、载药量较高。

2.3.1.4 磷脂-胆固醇比例 固定其他因素，选择磷脂-胆固醇比例 2.5∶1、 3∶1、4∶1、5∶1、7∶1，按 “2.2.2”项下方法制备脂质体。结果，两者比例4∶1时脂质体包封率、载药量较高。

在上述实验基础上，通过仿真方法生成三通道SAR系统单个多普勒单元的512个距离门的杂波数据，并在其中添加3个动目标信号，分别位于第127，255，384距离门。随后，采用本文算法及原有SAR-STAP算法对数据进行处理，并在图7中给出了杂波抑制结果。此次仿真中，目标信噪比设为20 dB，其他参数同前，所有结果均为500次Monte-Carlo实验的平均值。

2.3.1.5 水化体积 固定其他因素，选择水化体积1、2、3、5、7 mL，按 “2.2.2” 项下方法制备脂质体。结果，水化体积1 mL时脂质体包封率、载药量较高。

2.3.2 Box-behnken设计 在单因素试验基础上，考察胆酸用量 （A）、磷脂-药物比例 （B）、磷脂-胆固醇比例 （C）对脂质体包封率 （Y1）、载药量（Y2）的影响，结果见表2。

由此可知，最优工艺为胆酸用量9.06 mg，磷脂-药物比例7.23∶1，磷脂-胆固醇比例4.55∶1。然后，按照优化工艺制备3批脂质体，测定其包封率、载药量，结果见表5，可知模型拟合度良好，可信度高。

表2 试验设计及结果Tab.2 Design and results of tests

然后，通过 Design-expert 8.04软件对表2数据进行拟合，得到方程分别为Y1＝49.33－0.82A＋1.77B＋1.20C－1.49AB－0.43AC＋0.94BC－5.13A2－4.79B2－1.96C2（R2＝0.889 3）、 Y2＝1.93－0.11A－2.28B＋0.24C－0.070AB－0.015AC＋0.023BC＋0.081A2＋1.56B2＋0.14C2（R2＝0.994 9）， 方差分析表见表3～4。由表可知，模型具有显著性影响（P＜0.05）， 而失拟项不显著 （P＞0.05）； A2、 B2对包封率有显著影响 （P＜0.05），而B、C、B2对载药量有显著影响 （P＜0.05）。

表3 包封率方差分析Tab.3 Analysis of variance for encapsulation efficiency

响应面分析见图1，可知随着胆酸用量、磷脂-药物比例、磷脂-胆固醇比例增加，包封率均先增加后降低，可能与脂质体包载饱和程度有关。胆固醇在脂质体体系中起着 “流动缓冲剂”的作用，高于相变温度时可使脂质双分子层排列紧密，减少药物渗漏，从而增加包封率；但脂质体有一定包载程度，继续增加胆固醇用量时脂质双分子膜不对称性、膜通透性、刚性增加，导致药物渗透，包封率反而降低［15］。另外，磷脂-胆固醇比例增加可能在一定程度上提高药物包载率，即载药量有所增加。

表4 载药量方差分析Tab.4 Analysis of variance for drug loading

图1 包封率三维效应面图Fig.1 Three-dimensional effect surface diagrams of encapsulation efficiency

以《农村人民公社工作条例》的制定和修正过程为例。1961年3月22日，广州中央工作会议通过《农村人民公社工作条例（草案）》。紧接着，毛泽东要求把它放到群众中去征求意见以便修改。

2.2.2 逆向蒸发法［13］将处方量大豆卵磷脂和胆固醇加入24 mL三氯甲烷-乙醚 （1∶2）混合液中，搅拌至完全溶解，均匀加入适量黄芩苷PBS及胆酸，20℃水浴下超声10 min，形成稳定的W／O型白色乳剂，置于梨形烧瓶中，20℃水浴下旋转蒸发除去有机溶剂，形成可流动的胶态溶液，加入适量pH 7.0 PBS水化，继续旋转蒸发至形成淡黄色脂质体混悬液，将所得脂质体经0.22 μm微孔滤膜过滤3次，整粒减小粒径。

2.4 脂质体质量评价

2.4.1 外观 所得脂质体为淡黄色混悬液，4℃下放置几天后无分层现象。

表5 验证试验结果 （n＝3）Tab.5 Results of verification tests（n＝3）

2.4.2 物理稳定性 取6 mL脂质体，4℃下10 000 r／min离心15 min，未见明显分层现象，表明其物理稳定性良好。

总之，推进民生水利深入发展，重在深化认识，重在不断实践。应将民生理念贯穿于水利建设、管理、改革各个方面，体现在政策制定、工作部署、项目安排、业绩考核等各项工作中，把民生水利发展成效作为水利贯彻群众路线的重要标准，努力开创民生水利发展新局面。

2.4.3 透射电镜形态 取适量脂质体，pH 7.0 PBS稀释后，取适量滴加在铜网上，4 min后滴加1%磷钨酸溶液，染色30～60 s，自然干燥后在透射电镜下观察，结果如图2。由图可知，脂质体呈球形或类球形。

图2 脂质体透射电镜图Fig.2 Transmission electron micrograph image for liposomes

2.4.4 粒径、PDI、Zeta电位 取1 mL脂质体，20倍生理盐水稀释，测得其平均粒径 （图3）142 nm， PDI 0.190， Zeta电位－7.82 mV。

图3 脂质体粒径测定结果Fig.3 Results of particle size determination of liposomes

2.5 体外释放度 精密吸取相同浓度黄芩苷溶液、脂质体各3 mL，置于透析袋 （分子截留量10 000）中，两端扎紧，绑于桨上，置于200 mL pH 7.0 PBS中，37℃水浴100 r／min转速下动态透析，于0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 8、 10 h吸取3 mL释放介质，补足同温3 mL PBS，于315.5 nm波长处测定透析介质中游离黄芩苷含有量，计算累积释放度Q［16］，公式为 Q ＝C0V0＋（C1＋C2＋C3＋… ＋Cn－1）／m × 100% （Cn为第 n个取样点浓度， V0为释放介质体积，V为取样体积，m为原药量），再通过Origin 8.5软件绘制体外释药曲线，结果见图4。由图可知，黄芩苷溶液在6 h的累积释放率达到93.17%，而脂质体仅为57.83%。

文中充分利用Qt平台的优势，实现了ROV用户操作软件的设计；同时不再单纯考虑水下运动和实时监控功能，而是从多方面处理ROV的协作关系。虽然在细节方面仍有待完善，但是，通过泳池环境测试，验证了设计方案的可行性。

图4 样品体外释药曲线Fig.4 In vitro drug release curves for samples

黄芩苷在pH 7.0 PBS中溶解度最大［5］，故选择其作为释放介质，同时满足体外释药一定的漏槽条件。脂质体体外释药过程分为突释、缓释2个阶段，前一阶段释放较快，主要来自未包封的游离药物；后一阶段释放较慢，主要是由于包封在脂质体中的药物需要跨越磷脂双分子层，从而起到缓释长效的作用。

然后，通过Origin 8.5软件对脂质体和黄芩苷溶液体外释放行为进行拟合［17］，结果见表6。由表可知，两者均符合双相动力学模型。

表6 模型拟合结果Tab.6 Results of model fitting

3 讨论

3.1 制备方法筛选 泡腾分散法是指在制剂中加入碳酸盐与有机酸，遇水后产生CO2而调节释药行为的方法，其制备的脂质体粒径较小［13］。本实验在筛选胆酸-黄芩苷脂质体制备方法时发现，逆向蒸发法、泡腾分散法所得脂质体包封率均较高，但后者含有碳酸氢钠，胆酸可能与其发生反应而破坏自身结构，同时载药量也较低，故选择逆向蒸发法进行制备。

3.2 胆酸加入顺序及水化体积的影响 胆酸不易溶于水、乙醚、三氯甲烷中，单独加入水相或有机相中均难以溶解，故将其加入混合相中，并超声10 min乳化，同时包封率、载药量也有所增加，可能是由于胆酸具有表面活性剂作用。另外，水化时间太长会提高磷脂浓度，导致脂质体粒径增大，其聚集、絮凝几率也会上升，从而引起渗漏，稳定性降低。

3.3 “药辅合一”思想 “药辅合一”是中药制剂学中独特的用药理念，药物既具有一定药理活性，也可辅助其他药物或制剂，从而增强吸收、改变释放部位、协同增效减毒等［10］。胆酸是一种甾体化合物，在抗炎方面作用显著［18］，可协同其他药物发挥协同增效作用［19］，同时也能缓解毒性［20］。胆酸-黄芩苷脂质体中以黄芩苷为主药，胆酸为辅药，随着两者比例增加，脂质体抗炎作用、结肠炎靶向性也会随之提高，同时该制剂的成功制备也为后续炎症实验提供了基础。