高温大曲发酵过程中微生物多样性研究

付绍鸿，赵荣寿，杨 柳，周 蔺

（四川省古蔺郎酒厂有限公司，四川古蔺646523）

“曲是酒之骨”，酒曲的好坏直接影响着酒的产量和质量。不同类型大曲内微生物和酶类的组成与其具体的制曲生产工艺和地理环境息息相关。从宏观上看，不同香型大曲之间的差异主要是受环境条件（温度、湿度等环境因素）和制曲工艺措施的影响；从微观角度看，其本质是受各大曲中微生物种群组成和丰度，以及由此产生的符合酶系组分配比差异的影响。因此，从微生物学角度比较不同香型间的相互作用规律，具有较为重要的意义。

高通量测序技术是近几年发展起来的具有里程碑式的测序技术，其在微生物生态学研究中具有无可比拟的优势，随着测序费用的降低，该技术越来越多的替代DGGE、ARDRA等传统免培养技术。本文通过最新的高通量测序技术，对郎酒高温大曲制曲及储藏阶段微生物区系变化开展研究，为指导高温大曲功能微生物筛选应用、优化提升大曲制作工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

高温大曲样品：取自四川省古蔺郎酒厂有限公司，分别为入仓、翻曲、储存1个月、储存2个月4个时间段的同一批样品。块状曲药取样方法采用分层法，粉碎后曲药取样采用四分法。

仪器设备：2P-200型恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；YM-1000CT恒温超声仪，上海豫明仪器有限公司；TGL20M-Ⅱ冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；5810R台式冷冻离心机，德国Ep-pendorf公司；2720 thermal cycler PCR仪，Applied Biosysterms；DYCP-31 DNA电泳槽，北京六一仪器厂；DYY-5稳压电泳仪，北京六一仪器厂；FR980凝胶成像仪，上海复日科技仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大曲总DNA提取

大曲DNA提取方法参照叶光斌等的提取方法。

1.2.2 细菌的PCR扩增

细菌16S rRNA基因的PCR扩增所用引物为338F（5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）/806R（5’-ACT CTA CHV GGG TWT CTAAT-3’）；PCR反应体系为：PCR缓冲液（5×FastPfu Buffer）0.4 μL，2.5 mM dNTPs 0.2 μL，正反向引物（5 μM）各0.8 μL，DNA聚合酶（FastPfu Polymerase）0.4 μL，BSA0.2 μL，模板DNA10 ng，加双蒸水补齐至20 μL；PCR反应参数为：95℃预变性3 min，以下27个循环包括95℃预变性30 s；然后55℃退火30 s；72℃延伸45 s，最后一个循环72℃延伸10 min。通过对原始数据的筛选审查，得到优化序列，从而使序列质量提高，使分析的结果更具有可靠性。利用测序平台通过双末端测序（PE sequencing），可以将基因序列进行初级筛选，剔除测序质量较差的数据。通过barcode找对应编号样本，去掉引物，再把质量较差的序列剔除。基于序列相似度的方法，用Mothur等软件将序列划分为不同的OTU；对于核糖体序列，通常以≥97%的相似度确定为同一OTU。用RDP数据库当中序列的集合做对比，对单个OTU的分类信息进行归类。通过获取OTU信息，可以对文库进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 高通量测序及数据分析

经检测及PCR扩增，大曲DNA含量及PCR扩增产物的电泳结果见表1和图1。

从表1和图1可看出，大曲样品均获得有效提取和有效扩增，可满足后续高通量测序要求。

2.2 高通量原始数据获取

通过对21个样品细菌16S rRNA基因文库的高通量测序，共获得662525条序列，每个文库均获得20000条以上的测序序列，有效的保证了测序的覆盖率；各文库的覆盖率均达到99.9%以上。各样品测序数目、OTU数目、文库覆盖率和香农多样性指数见表2。

表1 不同大曲样品提取的DNA含量及OD值检测

图1 大曲PCR扩增结果和胶回收结果

从表2看出，随着大曲发酵时间的推进，大曲内细菌的多样性呈现波浪形变化，OTU数目在53～131之间，香农多样性指数在1.13～2.25之间。其中样品7的细菌多样性最为丰富，样品18的样品多样性最少。

2.3 不同大曲样品细菌多样性分析

为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP数据库对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平统计每个样品的群落组成。选择细菌16s细菌核糖体数据库Silva作为参比数据库。分别在门、纲、目、科、属的层次下对各样品的物种分布进行统计（见图2—图6）。

从图2可以看出，样品1—3的微生物种群主要是厚壁菌门和变形杆菌门微生物，随着发酵的进行，放线菌门的出现，变形菌门降低，到了发酵后期，厚壁菌门成为主要优势种群。

图2 不同大曲样品门级水平分布

由此可得，厚壁菌门在整个大曲发酵过程和储存中起关键作用，而变形菌门在发酵前期作用较明显。

图3 不同大曲样品纲级水平分布

如图3所示，在纲级水平上，1—3号大曲占优势的为芽孢杆菌纲和变形杆菌纲，4—9号大曲占优势为芽孢杆菌纲和放线菌纲，在整个发酵和储存过程中芽孢杆菌纲的丰度值最高，约占全部物种的90%以上。

由此可得，芽孢杆菌纲在整个大曲发酵过程和储存中起关键作用，而变形杆菌纲在发酵前期作用较明显。

如图4所示，在目级水平上，大曲发酵前期乳杆菌目和肠杆菌目占优势，随着发酵的进行，芽孢杆菌目的丰度值逐渐增大，发酵中后期约占全部物种的90%以上。

图4 不同大曲样品目级水平分布

由此可得，芽孢杆菌目在整个大曲发酵中后期过程和储存中起关键作用。发酵前期起主要作用的是乳杆菌目。

图5 不同大曲样品科级水平分布

如图5所示，大曲发酵前期肠杆菌科、乳杆菌科和明串珠菌科占优势，随着大曲发酵的逐渐推进，发酵中后期和储存过程中，芽孢杆菌科和高温放线菌科丰度值逐渐增加。

由此可得，肠杆菌科、乳杆菌科和明串珠菌科主要作用于大曲发酵前期，芽孢杆菌科和高温放线菌科在大曲发酵中后期和储存过程中起关键作用。

如图6所示，大曲发酵前期乳杆菌属和魏斯氏菌属占优势，随着大曲发酵的逐渐推进，发酵中期厌氧芽胞杆菌属和糖多孢菌属占优势，发酵后期及储存过程中，Lentibscillus和Kroppenstedtia占主要优势。

图6 不同大曲样品属级水平分布

3 结论

本文利用高通量测序技术对发酵和储存过程中的微生物区系变化进行了初步分析，分析结果显示：

（1）随着大曲发酵时间的推进，大曲内细菌的多样性呈波浪形变化；

（2）在门级水平上，厚壁菌门在整个大曲发酵过程和储存中起关键作用，而变形菌门在发酵前期作用较明显；在纲级水平上，芽孢杆菌纲在整个大曲发酵过程和储存中起关键作用，而变形杆菌纲在发酵前期作用较明显；在目级水平上，大曲发酵前期乳杆菌目和肠杆菌目占优势，芽孢杆菌目在整个大曲发酵中后期过程和储存中起关键作用；在科级水平上，肠杆菌科、乳杆菌科和明串珠菌科主要作用于大曲发酵前期，芽孢杆菌科和高温放线菌科在大曲发酵中后期和储存过程中起关键作用；在属级水平上，乳杆菌属和魏斯氏菌属在大曲发酵前期占优势，厌氧芽胞杆菌属和糖多孢菌属在大曲发酵中期占优势，Lentibscillus和Kroppenstedtia在大曲发酵后期及储存过程中占优势。