基于双抗夹心ELISA法来检测血浆中凝血酶

摘要：双抗体夹心ELISA法是最常使用的免疫分析技术，目前在各个领域都取得了广泛的运用。通过分析该方法在其他领域的应用现状，再结合该方法在检测凝血酶中的运用，得出采用ELISA法来检测血浆中凝血酶原的含量，具有较高的有效性、稳定性，在临床中可以广泛地应用。

关键词：双抗夹心ELISA法；凝血酶；稳定性

凝血酶原就是凝血因子Ⅱ，它主要依赖于维生素K，在肝脏中经过肝细胞合成，经过活化可以转变为相应的凝血酶。在对众多疾病的发病机制和临床症状进行研究时，测量凝血酶的含量具有十分重要的意义，但现阶段临床检验中尚不存在高效、简便及准确的方法来检测凝血酶。目前，双抗夹心ELISA法是使用最广泛的一种免疫分析技术，已广泛应用到临床检测、毒品测定等各个领域。

1双抗体夹心 ELISA 法的研究进展

庄翘楚等[1]研究分析了双抗夹心ELISA法对双歧杆菌进行检测的最优反应条件。采用实验室所提取的兔抗及鼠抗两种两歧双歧杆菌免疫血清，运用相應的方法来筛选两种血清的反应浓度，之后再对比分析反应所需的封闭液、反应所需时间及底物反应所需时间等，从而明确双抗夹心ELISA法对双歧杆菌进行检测的最优条件，为日后测定双歧杆菌的含量提供有效的依据。吴序栎等[2]分析研究了双抗夹心ELISA法对食物中虾过敏原的测定方法及效果，为有效的预防及治疗食物过敏提供了可靠的理论依据。其方法为：分离提取虾中的过敏原蛋白，利用免疫小鼠制作出相应的抗体，同时将该抗体作为包被酶标板，利用生物素来为抗体做标记，创建起科学的双抗夹心ELISA法，成功检测出虾过敏原的成分，该方法具有较强的灵敏度，为深入研究ELISA法检测虾过敏原提供了有效的依据。何启强等[3]分析研究了双抗夹心ELISA法测量HSP70的含量，创建相应的标准曲线，测定出了相应的回收率、精准度及检出限的最下值，结果显示采用该方法来测定HSP70具有较多的优点，如较高的灵敏度、特异性及可靠性。陈家杰等[4]创建了有效的双抗夹心ELISA法，并运用该方法对食物中大豆的过敏原成分进行检测，从而为预防及治疗食物过敏性疾病提供了相应的技术支持。分离大豆的总蛋白，利用免疫小鼠制定出相应的抗体，同时运用将该抗体作为包被物质，并采用生物素来标记抗体，将其作为捕捉抗体，从而创建科学有效的双抗夹心ELISA法。该方法具备较高的灵敏度及可靠性，能够同时对十种样品的过敏原含量进行测定。

2双抗夹心ELISA法检测凝血酶的实际应用

2.1研究材料及研究方法

正常对照组：选取一定的数量的健康人，对其进行体检，排除肝、肾等病史，排除出血症状，近期内没有服药史。

肝硬化组：根据我国所制定的相关诊断标准，选取一部分符合诊断标准的病例，其均由消化专科的医师进行确诊。

提取血浆时所运用的抗凝剂为枸橼酸。

2.2研究仪器及研究试剂

研究试剂：兔抗人凝血酶原抗体，过氧化物酶标记的兔抗人凝血酶原抗体，凝血酶原标准品，牛血清白蛋白等。

研究仪器：酶标仪与洗板机等。

2.3研究方法

根据常规的方法来检测血浆中的凝血酶。其操作步骤如下：选用已被兔抗人凝血酶抗体包被的96微孔板，每孔注入100ul的液体，在温度为14℃的条件下过夜。封闭液所运用的为0.5%的BSA，在37℃的条件下放置半小时。洗涤液选用PBS，经过标准的洗涤之后，在微孔板内加入梯度稀释的凝血酶原标准品及样本血浆，每个孔注入100ul，两个平衡，在37℃的条件下放置一小时。同时对过氧化物酶标记的兔抗人凝血酶原抗体进行稀释，经过标准的洗涤之后，将其加入其中，在37℃的条件下放置半小时。经过标准的洗涤之后，将相应的显色剂加入到96微孔板内，采用硫酸来终止该反应。最后运用酶标仪进行测量，吸光度值为450nm。

2.4研究结果

2.4.1正交试验优选

该试验可以对包被液的浓度、过氧化物酶标记的抗凝血酶原抗体稀释比例以及封闭液的类型进行优化选择，得出最佳的包被浓度为10 mg/L，相应的抗体稀释比例为1：1000，而封闭液则运用了0.5%的BSA。

2.4.2线性分析

利用PBS来稀释凝血酶原的标准品，其具体的稀释比例为1：5、2：5、3：5、4：5及原有浓度。采用双抗夹心ELISA法来检测凝血酶数值，结果显示在该范围之内具有较好的线性关系。

2.4.3灵敏度

采用零标准管进行反复检测，至少保持10次，得出最小检测限，在相应的吸光度值下进行测量，得出相关的标准曲线，通过计算得出相应的凝血酶浓度，其数值为7.5mg/L。

2.4.4检测回收率

取已知凝血酶一份，其浓度为5mg/L，通过常规检测，将标准品以500、1000 mg/L的量加入其中，检测回收率，计算出所需数值。

2.4.5检测重复性

取已知的凝血酶，其原有含量为5 mg/L，采取相关的方法进行检测，得出相应的重复性。

2.4.6样本的稀释比例

为了使非特异性的吸附度降低，经过相关的实验得出，以1：1000的比例来稀释血清样本。

2.4.7研究样本存放时间的影响

处于无菌的条件下，将新鲜的血液进行分离，提取出血浆，将其处于4℃的温度环境中放置一周，在零下20℃的温度环境中放置一个月，经过试验发现并未对最终数据产生影响。

3讨论

大部分凝血因子及抗凝血因子都是在肝脏中合成及失活的，患有肝病的患者多存在严重的凝血功能障碍。肝硬化患者最常见的临床症状是出血，其造成出血的主要原因是由于肝脏中合成凝血因子及血小板等含量的降低，肝脏功能异常所导致。相关的研究多集中于肝硬化患者的凝血及止血功能的检测意义，极少涉及凝血酶原的含量测定。经过试验检测，肝硬化患者的凝血酶原含量呈现显著降低，双抗夹心ELISA法能够有效的测定出肝硬化患者的凝血酶原含量，该检测方法具有较高的可靠性及精确性，能够作为早期肝功能指标的检测方法。

运用双抗夹心ELISA法对正常人的凝血酶原含量进行检测，通过与以往的文献进行对比分析，得出该方法与其他方法所检测出的结果基本相同。目前，临床上多采用凝血酶原的检测来呈现集体内外源性凝血途径的情况，但此方法所应用的范围较为有限，仅仅用于外源性凝血系统凝血因子缺陷的初筛。本文通过双抗夹心ELISA法来测量凝血酶原的含量，结果显示，各个指标均与相关的检测要求相符合。

结论

双抗夹心ELISA 法具有较多的优势，如高效、迅速、精确、可定量、易操作、所需的大型设备较少等，且该方法并不需要较高的样品纯度，十分适用于批量较多的样品检测，其具有极快的发展速度，在临床上取得了广泛的应用。

参考文献

[1]庄翘楚，孟祥晨.双抗夹ELISA法检测双歧杆菌反应条件的优化[J].中国乳品工业，2008，36（5）：55-58.

[2]吴序栎，吉坤美，李佳娜，et al.双抗体夹心ELISA法测定食物中虾过敏原成分[J].食品科技，2009（8）：240-243.

[3]何启强，杨进波，肖成峰，et al.双抗夹心ELISA法检测血浆HSP70的建立及初步应用[J].环境与职业医学，2004，21（1）：27-30.

[4]陈家杰，朱海，叶卫翔，et al.双抗体夹心ELISA法测定食物中大豆过敏原蛋白成分[J].食品研究与开发，2009，30（5）：105-109.

作者简介：王飞（1989.09-），性别：女，民族：汉，籍贯：天津市，当前职务：实验员，当前职称：初级工程师，学历：本科，研究方向：分子生物学ELISA。

（作者单位：凯熙医药（天津）有限公司）