微观研究生物降解塑料

塑料由于较低的成本以及理想的化学、力学、热和电等性能，被广泛用于包装、医疗、农业、电器、汽车以及加工行业。然而，塑料也是一个大污染源，常在经过短期使用之后便被扔进垃圾堆场，全世界的塑料垃圾以每年6000万t的速度在产生。基于环境保护的出发点，处置塑料的各种措施和方法相继出现，生物降解路径便是其中之一。经济合作与发展组织（OECD）早先针对化学品提出“快速生物降解性”的概念，要求在28 d的测试期限内的10 d窗口期应达到60%生物降解，规定将10%的生物降解程度定为该窗口期的起点。文献中已出现几种具有可比性生物降解的塑料品钟，如聚己酸内酯、己二酸琥珀酸共聚丁二醇酯、聚乳酸、聚丁二酸丁二醇酯等。

生物可降解塑料是微生物的一种碳来源和能源，在有氧条件下的生物降解反应可以用方程式（1）来表示：

聚合物的碳（C聚合物）被微生物吸收（转为C生物质），而后矿化成CO2和H2O或用于生长和再生产（更多C生物质）。C生物质经较长时间矿化，在土壤微生物种群或储藏的聚合物的作用下产生CO2。其结果是CO2的快速生成后，接着是较慢第二阶段的CO2逸出，这两种模式属可被认知的有机物质矿化方式。方程式（2）是更准确的生物降解表达。

C聚合物转化为C生物质，然后C生物质再以不同的动力学（b）转化为CO2。严格地说，反应（a）是生物降解，而反应（b）是矿化。与化学反应类似，可通过跟踪反应物的消耗或产物的出现来监控生物降解过程。从技术角度来定量化监控生物降解的最好方式是计量反应物或是能量新陈代谢的终产物。

生物降解的百分数是放出的CO2与理论量CO2的比值。理论量CO2为投入反应器塑料样品中的元素碳全部氧化所应生成的CO2量。

这一呼吸测量方法是借鉴经济合作与发展组织在20世纪80年代发布的关于化学品测试的指导书的内容建立的。

1 材料和方法

1.1 材料

所用材料为聚葵二酸丁二醇酯（PBSe）——一种生物可降解性脂肪族聚酯。经元素分析，其m（C）=65.43%，密度为1.12 g/cm3。以原有形态（小球）或经液氮冷冻研磨和筛分后做土壤生物降解的试验。得到的三部分颗粒尺寸范围为：500～700 μm，200～355 μm，50～75 μm。

将微晶纤维素 ［m（C）=44.44%］粉末作参比物。

1.2 比表面测定

每一级粉末依颗粒测定比表面积（cm2/g），视颗粒为不等边椭圆体，取20个颗粒以量规测定3个坐标轴的长短径，用下式计算表面积：

式中 a，b和 c为半坐标轴，p为1.607 5（克努兹-汤姆森校正系数）。再由表面面积和20个颗粒的平均质量计算比表面积（cm2/g）。

粉末的比表面积经三种方法得出：（1） 理论方法计算；（2） 扫描电镜图像处理；（3）BET测定方法。

1.3 生物降解

生物降解依照 ASTM D5988—12标准方法测定，结果是基于所产生的CO2量。

聚葵二酸丁二醇酯的不同筛分是以微晶纤维素作参比物一起进行土壤降解。试验数量为每个反应器投1 g，也有一些筛分试验量加倍（每个反应器投2 g）。材料试验中产生的CO2净量，可通过从投入有聚合物的反应器中产生的CO2量扣掉投入空白土壤的反应器所产生CO2的平均量计算而得。生物降解的百分数，为试验产生的CO2净量与基于聚合物碳的CO2理论生成量之间的比值。

2 结果讨论

2.1 粒子尺寸确定

将20个颗粒计量其尺寸和质量，再由此来测定其平均比表面（cm2/g）。以理论方法估计不同筛分部分的表面积，将每一部分的粒子视为直径等于每一级范围极限中值的球体。见表1。

为了核实这一假设，曾进行图像分析比照（结果差异均在观测误差范围之内）。另外，还进行BET分析，所测得结果比其他方法高3～5倍。

表1 由理论方法确定的比表面积

2.2 生物降解

各反应器累计生成的CO2如图1所示，对比试验显示的进程多数可重叠（相同征象，即图中实线和虚线所示），只是总表面积分别是1 651 cm2和1 649 cm2的R11和R12在20～60 d之间出现分叉。图1中各反应器R1-R16的内容物见表2。

图1 不同反应器R1-R16放出CO2的进程图

图2 展示了PBSe生物降解平均曲线，原有形态PBSe（表面积=33cm2的小球）的试验结果是最慢的。当在138 d之后，所有曲线在80%高台区均位于80%和90%范围间，唯有33cm2小球例外地仍处在连续的生物降解中。

有关将生物降解视为塑料表面发生多相反应的见解，为生物降解塑料领域工作的科学群体所创立。然而，阅读已有文献，发现少有文章系统化地论述表面对生物降解的影响，亦是以相同条件测试具有不同有效表面积的相同样品。

将不同颗粒尺寸的可生物降解聚合物置于土壤中进行生物降解试验，其不同尺寸的分级经由研磨并筛分塑料颗粒而得，表面积的测定基于一种经过显微图像分析验证的理论方法。由另一实验室做BET测定，该方法测得的表面积值比理论测定和图像分析法要高3～5倍，因为BET是可以测定纳米层级的多孔性。具有不同粒径样品的生物降解进程有时会有显著差异。聚焦在生物降解的起始部分进行分析，当预料生物降解的速率是直接受聚合物矿化作用的影响，而不是受生成的生物质的矿化影响，这个假设意指塑料粒子被一层会侵袭塑料的生物膜所包覆，通常可观察到渐进式的塑料件腐蚀与在样品表面菌丝体的密集生长有关。反应起始部分的生物降解曲线以线性回归很好地进行表达。这意味着反应速率遵循准零级动力学，即反应速率为常数，不受物质（聚合物）量所影响。很显然，几个月时间里反应速率不变，也不受有效聚合物影响。为解释这一恒定的速率，可认为生物降解速率受表面有效聚合物量的影响，而不受聚合物总量的影响。由恒定腐蚀所引起的表面变化与降解的起始阶段不相关。

2.3 确定生物降解速率

每个筛分的剩余量C聚合物，通过在时间起点的C聚合物量减去放出的净CO2的C量来确定。为了确定起始矿化速率k，从每一个样品的第一生物降解阶段C聚合物数据进行线性回归分析（见图3）。线性回归分析的结果列于表3中，其斜率常数k即为矿化反应速率（mg C聚合物/d），b 为截距常数，r2为试验的相关系数。

矿化速率与表面积的关系采用回归分析（简单回归）获取，结果表明双倒数模型最为适合（r2为98.7%）。双倒数模型又称为莱恩威弗伯克作图法，用于米氏方程表达酶动力学。在图4中，将聚合物起始总表面积的倒数（cm-2）与反应速率的倒数（k-1）拿来做线性回归，得到双倒数作图法的线性回归方程如下式（其相关系数r2=0.987）。

y=11.557x+0.0103

y轴的截距为最大反应速率的倒数(1/k最大)，如此则最大反应速率为1/0.0103=97 mg/d。换句话说，在最佳条件下，反应速率随着有效面积的增加而上升直至到达最大值。

x轴的截距（即当y=0）为x=-0.0103/11.557=-0.0008912，其倒数值为1122 cm2。在酶动力学中，这就是米氏常数（Km），亦即反应速率处在最大值一半时的物质浓度。在此，Km代表反应速率为最大值的一半时的表面积。如此，则表面积在1122 cm2时反应速率是最大值的一半。

表2 生物降解试验的内容物

图2 不同起始表面积PBSe的生物降解曲线

表3 线性回归分析结果

图3 生物降前期C聚合物随时间减少及回归线

图4 反应速率k与聚合物起始总表面积（cm2）双倒数作图

当不同样品的起始降解速率分别与起始有效表面相关联，双倒数作图法(即莱恩威弗伯克法)能很好地适应数据。用双倒数作图法估量的最大速率为 97 mgC聚合物/d，这可认为是分子水平的降解速率，亦即该阶段有效表面不限制降解（无限量的表面）。打个比方，如果1 g聚葵二酸丁二醇酯转换为纳米聚合物粒子，采取1 μm直径球体的形式，则总表面积约为53 500 cm2，表面可容许 95 mgC聚合物/d的起始速率，假如整个生物降解过程保持恒定，这个速率容许在7 d内达到90%生物降解门槛。显然分子水平的生物降解速率是非常快的，聚葵二酸丁二醇酯纳米聚合物亦可能满足经济合作与发展组织所提出的“容易生物降解”条件。

以通常实验室检测方法测试得出的塑料生物降解速率拿来判别生物的降解性是为“表观”速率。测试中发生在塑料表面的生物降解是很快的但是总的CO2逸出受到有效表面积限制，然而生物降解以逸出CO2与总碳（即Th CO2）的比值来计算，虽然多数碳不是“有效的”而是在塑料粒子的核心中包裹着，这样CO2/Th CO2比值未能准确表达现实中发生的生物降解过程。塑料粒子显现了很慢的生物降解结果，但是如果基于这个结果断定聚葵二酸丁二醇酯的生物降解是慢的，则也不是准确表达出全速新陈代谢在分子层面所发生的境况。

从数据得出在未限定表面积的情况下，在设定条件下聚葵二酸丁二醇酯最大的生物降解速率为97 mg·C聚合物/d，（1 d 时间，97 mg聚合物碳矿化为CO2）。断定特定的最大速率业已确定从而也意味着存在限制因素。我们相信限制因素是土壤中存在的活性微生物细胞的数量，而倾向于排除营养物缺乏这一因素，因为生物降解测试中所用的土壤添加了盐，尤其是氮，磷和钾。在酶的反应中发现了类似条件，在无限定物质可用性情况下酶浓度作为反应的限制因素。酶不像微生物会自身复制，因此微生物要应对增加的有效面积，可我们关注的是起始部分的反应，故对其生长的作用并不完全明了。我们期望同样土壤（以及同样环境条件）但不同的微生物量将显示不同的最大生物降解速率，需要做进一步试验来加以阐明。

意欲确证有效表面积对可生物降解聚合物的矿化速率的影响，以便从集中的CO2逸出速率判断分子水平的矿化动力学。研究表明塑料生物降解速率的确定受技术上可实现的颗粒大小的影响。这样判断生物降解速率应考虑计量CO2逸出速率受颗粒尺寸的影响，而未必说明这是一个快还是慢的反应的证据。固有生物可降解性的测定应基于一种方法对策，目的在于确定化学结构是否对酶的攻击敏感并最终转化为矿物质，尽可能减少偶然约束（如厚度、温度、水活性等），为危险性评估的另一方面。

一般来说，在实验室条件下给定最长的时间内，一种塑料如能达到以矿化形式体现的最小的生物降解程度，便是生物可降解性合格的。这样关于生物可降解塑料的标准描述为计量生物降解速率即定义了试验方法并设置最小生物降解速率的要求。生物降解水平设为90%，涉及土壤的时间期限为几个月甚至是几年。如此，关于生物可降解性塑料的要求不同于经济合作与发展组织规定的必须在最长28 d内证明生物降解的要求。似乎塑料的生物降解很缓慢，然而，此项工作表明在土壤中发生在分子水平的生物降解是很快的。

为了清楚起见，必须说明此项研究仅是聚焦在典型聚合物固有生物可降解性以及最大理论生物降解速率的评估上，所用的测试方法表明聚葵二酸丁二醇酯的最大生物降解速度很快，证明这种聚合物在化学上适合于生物降解。然而，以这种聚合物所做任何产品的物理性能将受厚度（亦即有效的表面积）以及环境条件（温度、水活性、营养物可用性、微生物种群等）的影响。

3 结语

聚葵二酸丁二醇酯在土壤中的生物降解速率与有效的表面积相关联，其功能运用双倒数回归模型进行表达，也就是通常应用在酶动力学中测定米氏方程动力学参数的所谓莱恩威弗伯克作图法。这就使得在非限定表面积的情况下，估计可达到的聚合物最大生物降解速率成为可能。据我们所知，这是首次对固体聚合物的最大生物降解速率的评估。

如果聚合物能以纳米聚合物的方式测试，则很可能满足经济合作与发展组织有关化学品“快速生物降解性”的标准。贴切地说，根据欧洲的“REACH”（化学品注册、评估、许可和限制）规则，一旦物质满足“快速生物降解性”试验要求，可假定其在生物活性环境中经历了快速而终极的降解。可见，在分子水平上的生物降解评估，将可导致生物可降解塑料对环境作用较好的理解。

当所有可用的微生物以及酶器材全部参与到生物降解中，没有更多物质（指更多针对微生物的有效表面积）可被降解时，就达到最大生物降解速率。这一假设意味着通过改变开始试验时存在的微生物数量，就可获得不同的最大反应速率的结果。需要进一步研究来支撑这一假设以及得出结论。