伏立诺他协同PI3K抑制剂NVP-BEZ235诱导Jurkat细胞凋亡

陈明　李君君　肖红　黄力君

[摘要] 目的 探讨伏立诺他联合PI3K抑制剂NVP-BEZ235对Jurkat细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。 方法 体外培养Jurkat细胞，用不同浓度伏立诺他或（和）NVP-BEZ235孵育后，采用MTS观察两者单独用药或联合用药对细胞的增殖的影响，流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测PI3K/Akt磷酸化及Bim1表达。 结果 0.12、0.24、0.36、0.48和0.60 μmol/L伏立诺他和6、12、18、24、30 nmol/L NVP-BEZ235对Jurkat细胞的生长增殖具有协同作用。伏立诺他或（和）NVP-BEZ235也可促进Jurkat细胞凋亡，并抑制PI3K/Akt磷酸化，上调Bim1的表达。 结论 伏立诺他对PI3K抑制剂NVP-BEZ235抑制Jurkat细胞生长具有协同作用，并能诱导Jurkat细胞凋亡，其机制与影响Bim1有关。

[关键词] 伏立诺他;急性T淋巴细胞白血病;PI3K抑制剂;NVP-BEZ235;Jurkat细胞凋亡

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）02-0029-03

急性T淋巴细胞白血病（acute T lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一种好发于儿童和成人的造血系统恶性肿瘤，其发病率低，预后差。因此，进一步阐明T-ALL的癌变环节，寻找有效的分子靶点是当前提高T-ALL治愈率的首要任务。研究表明，PI3K/Akt信号传导通路在细胞生长、增殖、凋亡全过程起着重要的调控作用，在T-ALL中，PI3K/Ak往往异常激活[1]，同时，也与血液系统肿瘤的耐药有关[2]。而采用PI3K抑制剂处理后，可诱导其周期阻滞和凋亡[3]。这表明针对PI3K/Akt的靶向治疗，则可有效延缓肿瘤的发生发展。NVP-BEZ235是一种新型PI3K抑制剂。近年来，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACi）在肿瘤的治疗中受到广泛关注，并可增强多种抗肿瘤药物的活性[4，5]。本研究拟探讨新型HDACi伏立诺他联合NVP-BEZ235对A-TLL细胞增殖的影响，并探讨其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人T细胞白血病Jurkat来自中国典型培养物保存中心。MTS试剂盒购自Promega，NVP-BEZ235、伏立诺他购自Merck。鼠抗人抗体β-actin抗体、鼠抗人Bim1抗体购自Santa Cruz。凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天。

1.2 细胞培养与活性检测

细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 g/L链霉素的RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。以每孔约2500个细胞接种在96孔板中，24 h后，细胞用0.12、0.24、0.36、0.48和0.60 μmol/L伏立诺他和6、12、18、24、30 nmol/L NVP-BEZ235处理72 h。根据试剂盒的说明，在酶标仪上570 nm处读取吸光度。根據参考文献提供的方法计算药物联合指数（CI）值：CI=1，叠加;CI<1，协同;CI>1，拮抗[6]。

1.3 Western blot检测蛋白表达及磷酸化

收集处理后的细胞，加入蛋白提取试剂充分裂解。蛋白提取物以14 000 r/min离心15 min后，在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离总蛋白，并转移至硝酸纤维素膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭后，与相应的一抗4℃温育过夜。最后用辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育，化学发光、显影。

1.4 细胞凋亡的检测

培养3×105个细胞24 h，用0.48 μmol/L伏立诺他或（和）24.0 nmol/L NVP-BEZ235处理细胞48 h。每次大约测定100 000个细胞。用流式细胞仪测定细胞的凋亡率。

1.5 统计学方法

所有数据重复3次，用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度伏立诺他和NVP-BEZ235对Jurkat细胞生长增殖的影响

6～30 nmol/L NVP-BEZ235单独处理Jurkat细胞72 h后，随着其浓度的递增，细胞抑制率逐渐增高。0.12～0.60 μmol/L 伏立诺他处理也得到了类似的效果。但联合用药后，随着两者浓度的递增，细胞生长得到了进一步抑制。通过计算两者的联合指数CI后显示，0.12～0.60 μmol/L伏立诺他和6～30 nmol/L NVP-BEZ235对抑制Jurkat细胞的生长增殖具有协同作用（CI<1）。见图1。

2.2 不同浓度伏立诺他和NVP-BEZ235对Jurkat细胞凋亡的影响

对照组细胞凋亡率为（3.51±1.45）%，24 nmol/L NVP-BEZ235处理48 h后凋亡率为（17.92±3.21）%，0.36 μmol/L伏立诺他处理后凋亡率为（14.73±2.61）%，但伏立诺他和NVP-BEZ235联合用药后，凋亡率为（31.59±3.47）%，与单纯NVP-BEZ235或伏立诺他相比，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 伏立诺他和NVP-BEZ235对PI3K/Akt磷酸化的影响

Jurkat細胞中Akt的磷酸化水平较高，相对灰度值为（0.970±0.070），采用NVP-BEZ235处理后，Akt的磷酸化水平明显降低[灰度值为（0.610±0.040）]。单独的伏立诺他处理也能在一定程度上抑制Akt的磷酸化[灰度值为（0.340±0.010）]，但两者联合使用后，Akt的磷酸化水平进一步降低[灰度值为（0.015±0.050）]，见图2。

2.4 伏立诺他联合NVP-BEZ235对Bim1表达的影响

Western blot结果显示，采用NVP-BEZ235或伏立诺他处理后Bim1蛋白表达水平均有所增多，相对灰度值分别为（0.28±0.02）和（0.25±0.03），两者联合使用后，其灰度值降低至（0.57±0.08），见图3。

3讨论

PI3K/Akt信号传导通路与白血病、淋巴瘤等血液系统肿瘤亦密切相关[7]。Akt的异常活化预示着预后不良[7]。NVP-BEZ235主要选择性阻断PI3K的催化亚基p110α和p110γ的活性，不但可抑制乳腺癌细胞的生长，也能抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖[8]，同时对某些抗肿瘤药物如阿霉素、硼替佐米等药物也具有协同效应[9，10]。

肿瘤细胞的生物学行为也不是某一条信号通路单独作用的结果，往往受多重调控机制的相互影响、相互协调。因此，多种具有不同作用机制的药物联合应用是改善治疗效果的重要途径[11]。从流式细胞术结果可知，与对照组相比，伏立诺他、NVP-BEZ235均能上调凋亡细胞的比例，而伏立诺他和NVP-BEZ235联合使用后可进一步促进细胞凋亡。这表明伏立诺他联合NVP-BEZ235不但可抑制Jurkat细胞增殖，同时可加速其凋亡进程。

Bim1是Bcl-2家族仅含BH3区的亚家族成员[12]，在肿瘤的发生发展过程中也发挥重要作用，如采用RNA干扰沉默乳腺癌细胞Bim1表达后，可显著削弱紫杉醇诱导其凋亡[13，14]。在各种药物所致的肿瘤细胞凋亡中，Bim1表达显著增高[15]。表明Bim1参与了伏立诺他和NVP-BEZ235的促凋亡过程。

综上所述，伏立诺他和NVP-BEZ235联合使用可抑制Jurkat细胞的生长，二者具有协同效应。两者可下调Jurkat细胞中PI3K/Akt的活性，随后可上调促凋亡分子Bim1的表达而诱导凋亡的发生。但伏立诺他和NVP-BEZ235的协同作用机制比较复杂，是否还存在其他的分子机制，仍有待进一步研究。

[参考文献]

[1] Silva A，Yunes JA，Cardoso BA，et al. PTEN posttranslational inactivation and hyperactivation of the PI3K/Akt pathway sustain primary T cell leukemia viability[J]. J Clin Invest，2008，118（11）：3762-3774.

[2] Choi BH，Kim CG，Lim Y，et al. Curcumin down-regulates the multidrug-resistance mdr1b gene by inhibiting the PI3K/Akt/NF kappa B pathway[J]. Cancer Lett，2008， 259（1）：111-118，

[3] Pereira JK，Machado-Neto JA，Lopes MR，et al.Molecular effects of the phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor NVP-BKM120 on T and B-cell acute lymphoblastic leukaemia[J]. Eur J Cancer，2015，51（14）：2076-2085.

[4] Ohta H，Aoyagi K，Fukaya M，et al.Cross talk between hedgehog and epithelial-mesenchymal transition pathways in gastric pit cells and in diffuse-type gastric cancers[J]. Br J Cancer，2009，100（2）：389-398.

[5] Dummer R，Beyer M，Hymes K，et al.Vorinostat combined with bexarotene for treatment of cutaneous T-cell lymphoma：In vitro and phase I clinical evidence supporting augmentation of retinoic acid receptor/retinoid X receptor activation by histone deacetylase inhibition[J]. Leuk Lymphoma，2012，53（8）：1501-1508.

[6] Chou TC，Talalay P. Quantitative analysis of dose-effect relationships：The combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors[J]. Adv Enzyme Regul，1984，22：27-55.

[7] Morishita N，Tsukahara H，Chayama K，et al，Activation of Akt is associated with poor prognosis and chemotherapeutic resistance in pediatric B-precursor acute lymphoblastic leukemia[J]. Pediatr Blood Cancer，2012，59（1）：83-89.

[8] Baumann P，Mandl-Weber S，Oduncu F，et al. The novel orally bioavailable inhibitor of phosphoinositol-3-kinase and mammalian target of rapamycin，NVP-BEZ235，inhibits growth and proliferation in multiple myeloma[J]. Exp Cell Res，2009，315（3）：485-497.

[9] Schult C，Dahlhaus M，Glass A，et al. The dual kinase inhibitor NVP-BEZ235 in combination with cytotoxic drugs exerts anti-proliferative activity towards acute lymphoblastic leukemia cells[J]. Anticancer Res，2012，32（2）：463-474.

[10] Kim A，Park S，Lee JE，et al，The dual PI3K and mTOR inhibitor NVP-BEZ235 exhibits anti-proliferative activity and overcomes bortezomib resistance in mantle cell lymphoma cells[J]. Leuk Res，2012，36（7）：912-920.

[11] Zhao L，Au JL，Wientjes MG. Comparison of methods for evaluating drug-drug interaction[J]. Front Biosci（Elite Ed），2010，2：241-249.

[12] Gillings AS，Balmanno K，Wiggins CM，et al. Apoptosis and autophagy：BIM as a mediator of tumour cell death in response to oncogene-targeted therapeutics[J]. FEBS J， 2009，276（21）：6050-6062.

[13] Sunters A，de Mattos SF，Stahl M，et al. FoxO3a transcriptional regulation of Bim controls apoptosis in paclitaxel-treated breast cancer cell lines[J]. J Biol Chem，2003，278（50）：49795-49805.

[14] Ajabnoor GM，Crook T，Coley HM. Paclitaxel resistance is associated with switch from apoptotic to autophagic cell death in MCF-7 breast cancer cells[J]. Cell Death Dis， 2012，3：e260.

[15] Lee J，Bartholomeusz C，Mansour O，et al. A class Ⅰ histone deacetylase inhibitor，entinostat，enhances lapatinib efficacy in HER2-overexpressing breast cancer cells through FOXO3-mediated Bim1 expression[J]. Breast Cancer Res Treat，2014，146（2）：259-272.

（收稿日期：2018-09-11）