MassworksTM结合NIST11谱库在羊油香气成分准确定性分析中的应用

齐安安，马灵飞，雷春妮，张雅珩，马 鑫，庞伟强，周小平,

(1.西北师范大学地理与环境科学学院，甘肃 兰州 730070；2.中南大学化学化工学院，湖南 长沙 410012；3.甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，甘肃 兰州 730070；4.江苏理工学院，江苏 常州 213100)

食用油是人们生活的必需品，在增加食物色、香、味方面起着重要作用，也是人体不可缺少的营养来源之一[1]。羊油属于食用油的一种，具有补虚、润燥、祛风、化毒之功效[2-4]。目前，对植物油风味以及香气成分的研究较为普遍，如番茄籽油、花生油、芝麻油和芝麻香精等[5-9]，但对羊油香气成分的研究则鲜有报道。

测定香气成分常用的样品预处理方法主要有顶空法、固相微萃取法、同时蒸馏萃取法、加速溶剂萃取法等，这些方法在一定程度上可解决复杂基质干扰问题，但各有其局限性。顶空法操作简单，但灵敏度低；固相微萃取法的萃取头对挥发性成分的吸附具有选择性，不能全面反映样品的挥发性成分；同时蒸馏萃取和加速溶剂萃取等传统技术通常需消耗大量有机溶剂，对人体和环境都会造成危害。热脱附法操作简单、灵敏度高、无需使用有机溶剂，绿色环保[10]，目前已用于检测空气环境、花香以及材料等的挥发性有机物[11-12]，而将其用于测定食品风味的研究较少，尚未见热脱附法应用于动物油香气成分分析的报道。

香气成分的定性一般通过单一谱库匹配度结合保留指数确定，实验步骤较繁琐。由于低分辨质谱中的杂质、噪声与化合物共流出物以及同位素离子峰的影响[13]，仅使用低分辨质谱对目标物定性时，会出现同一质谱图具有多个高匹配度的化合物、匹配度相近、匹配度极低的现象[14]，且无法精确测定化合物的质量[15]，这给化合物的准确定性造成困难，而高分辨质谱的应用成本较高[16]。MassworksTM质谱解析软件利用精确质量数测定和线性同位素峰形校正专利技术，使低分辨质谱实现了高分辨的功能[17-18]。国内外均有MassworksTM在化合物定性分析方面的应用研究。其中，Groveman等[19]用MassworksTM实现了石墨烯氧化物精确质量数的测定；周围等[20]利用其实现了玫瑰精油中部分天然产物的分析并确定了元素组成。利用MassworksTM可以由已知的离子式计算出准确理论分子质量，通过峰形矫正，获得对称的峰形图[21]。对实测的原始扫描质谱图，通过校准获得优化后的质谱图，其质量准确度大大提高，可使低分辨质谱获得高精度的质谱图。

本研究拟采用热脱附-气相色谱-质谱联用技术(TD-GC/MS)分析羊油的香气成分，利用MassworksTM质谱解析软件结合NIST11谱库对检测到的挥发性成分进行定性分析，希望为天然产物香气成分的分析研究提供方法借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司产品；MassworksTM质谱解析软件：美国Cerno Bioscience公司产品；AutoTD自动热脱附解吸仪、不锈钢采样管(90 mm×6.4 mm，内装150 mg Tenax-TA吸附剂)、集热式恒温加热器、20 mL顶空瓶：中国成都科林仪器公司产品；SHC型计量型空气泵：山东塞克赛斯氢能源有限公司产品； KQ-600DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；正己醇标准品：国药集团化学试剂有限公司产品；β-蒎烯、1,4-二氯苯、柠檬烯：天津市登峰化学品有限公司产品。

1.2 样品制备与采集

将市售羊肉脂肪切碎，置于钳锅中，于105 ℃烘箱中熬制1 h，获得液体羊油样品。用移液管移取8 mL羊油样品于20 mL顶空瓶中，立即封口，置于集热式恒温加热器中，在80 ℃下通过隔垫将已老化好的不锈钢采样管一端插入顶空瓶中(距离油面1 cm)，并在顶空瓶顶端插入细铜管与外界相通，以保持顶空瓶内气压平衡，不锈钢采样管另一端与空气泵相连，以150 mL/min的速率采集60 min，采样结束后将采样管取下，密封，待测。

1.3 仪器参数

1.3.1热脱附仪条件 一级解吸温度180 ℃，解吸时间5 min；二级解吸温度280 ℃，解吸时间8 min；进样时间60 s；冷阱温度-30 ℃；传输线温度200 ℃；阀温度150 ℃；载气：高纯氦气(纯度≥99.999%)，载气压力90 kPa；驱动气体为空气。

1.3.2色谱条件 色谱柱：HP-INNOWAX(60 m×0.250 mm×0.5 μm)；程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升至210 ℃，保持1 min；载气为高纯氦气(纯度≥99.999%)；进样口温度260 ℃；恒压模式68.95 kPa；分流比为5∶1。

1.3.3质谱条件 EI离子源；电子能量70 eV；接口温度250 ℃；离子源温度230 ℃；溶剂延迟3 min；采样模式为全扫描，质量扫描范围m/z25～550。以全氟三丁胺(PFTBA)标准品为外标对质谱图进行校正。

2 结果与讨论

2.1 参数优化

热脱附的吸附时间、冷阱条件会对样品测定产生较大影响。因此，依据所测物质的组分数量和总峰面积[22]，通过对吸附时间、冷阱温度进行优化，确定分析羊油香气成分的最优热脱附参数。

2.1.1吸附时间优化 吸附时间对样品香气成分富集影响较大，本实验考察了吸附时间为20、40、60、80 min的测定结果，示于图1。随着采样时间的增加，总峰面积和化合物个数均增加，但吸附80 min时，总峰面积和化合物个数均有减少趋势，这可能由于过长的吸附时间影响了吸附-解吸平衡。综合考虑样品分析的效率，最终选择吸附时间60 min。

2.1.2冷阱参数优化 设置其他条件不变，考察冷阱捕集温度为0、-10、-30 ℃时对测定结果的影响，示于图2。随着冷阱温度的降低，总峰面积和化合物的个数均增加，在-30 ℃时化合物个数和总峰面积均最高，由于仪器的冷阱捕集温度最低为-30 ℃，故将冷阱的捕集温度确定为-30 ℃。另外，对冷阱的解吸时间(5～10 min)和解吸温度(260～280 ℃)进行优化。结果表明，冷阱的解吸时间和温度对总峰面积和香气组分个数均未产生明显影响，为避免每次进样交叉污染，最终确定解吸温度为280 ℃，解吸时间为8 min。

图1 吸附时间对测定结果的影响Fig.1 Effect of adsorption time on measurement results

图2 冷阱温度对测定结果的影响Fig.2 Effect of cold trap temperature on measurement results

2.2 建立校正函数

全氟三丁胺性质稳定，很难与其他物质反应，质谱裂解状态固定，裂解效率、离子响应均较高，将其作为校准标准品，用MassworksTM软件对质量轴和质谱峰形进行校正。选择合适的质量扫描范围(m/z400～410)获得质谱图，全氟三丁胺离子碎片的质量数几乎涵盖了目标化合物的质量扫描范围(m/z25～550)，即以碎片CF3+、C2F4+、C2F5+、C3F5+、C4F9+等进行校正。优化FWHM Overall Fraction参数(可优化范围为0.4～0.2)，使精确质量数达到最优，所得谱图精度均在99.4%以上，质量误差控制在0.356 3 mu以内。

根据标定离子的理论质量数和同位素分布获得校正函数，该函数适用于常用的质量范围(m/z0～500)。利用MassworksTM将校正函数运用于羊油香气的原始扫描质谱图中，校正后获得目标物的精确质量数，再经MassworksTM线性同位素峰形校正检索技术(CLIPs)，实现了目标物分子式的准确识别。

2.3 样品成分分析

2.3.1MassworksTM技术应用 由TD-GC/MS得到羊油香气全扫描模式下的总离子流色谱图，首先进行NIST11谱库检索，由于受到多种因素干扰，保留时间在10.897、19.928、20.473、26.102、28.809、29.869、30.480、53.674 min的色谱峰匹配度均比较低，即使在NIST11谱库检索中逐个扣除背景，仍无法排除干扰。利用MassworksTM进行峰形校正，通过优化功能参数获取最佳的谱图精度，可大大提高样品谱图与NIST11谱库的正反匹配度。对羊油香气原始扫描图，保留时间在10.897 min处的色谱峰通过MassworksTM背景扣除前后的对比，示于图3。背景扣除后，m/z28.036 7、32.025 5等干扰碎片离子被扣除，将未知化合物的质谱图与标准谱图比对，可获取未知化合物信息。背景扣除前后的化合物信息列于表1，可见，背景扣除前的质量误差为9.433 7 mu，背景扣除后的质量误差降至6.633 7 mu。

2.3.2共流出物的判断 为确定羊油色谱峰中是否有共流出化合物，以40.032 min处的色谱峰为例进行分析，结果示于图4。其质谱图中有3个相对丰度较高的离子峰，分别为m/z145.978 9、147.972 7、149.949 5，利用MassworksTM质谱解析软件的CLIPs功能逐一进行检索，其中m/z147.972 7、149.949 5离子峰在MassworksTM参数允许范围内未检索到化合物，m/z145.978 9处碎片离子峰检索到谱图精度98.55%，质量误差9.5 mu的化合物C6H4Cl2，经与标准品比对验证，与MassworksTM确定结果一致。因此，MassworksTM的CLIPs功能可为判断是否有共流出化合物提供参考。

图3 MassworksTM扣除背景前(a)、后(b)的质谱图Fig.3 Mass spectra of before (a) and after (b) subtracting background by MassworksTM

背景扣除Subtracting background分子式Formula精确分子质量Exact mass质量误差Mass error/mu谱图精度Spectral accuracy前C6H8O96.0579.433799.8007后C6H8O96.0576.633799.8158

2.3.3不稳定化合物的分析 在质谱裂解过程中，一些醇、醛类化合物不稳定[23]，其质谱图中分子离子峰丰度较低，很难直接确定，可利用MassworksTM对质谱图的离子碎片信息进行检索，通过离子碎片匹配分析部分裂解机理。如保留时间32.594 min的化合物M，通过MassworksTM解析出其碎片离子分别为C6H12+、C5H9+、C4H8+等，结果列于表2，其碎片离子峰形图示于图5。目标化合物发生电离，失去氧原子的1个n电子，生成奇电子离子，游离基定域于氧上，并诱导β氢重排到氧上，接着失去H2O，得到[M-H2O]+奇电子离子m/z84。该奇电子离子继续分解，失去稳定的中性基团，得到[M-H2O-(CH2)2]+奇电子离子，即m/z56；或者[M-H2O]+离子发生α断裂，失去H生成[M-H2O-H]+偶电子离子，继续分解失去稳定的中性基团，得到[M-H2O-H-CH2]+偶电子离子m/z69。由此可推测：未知目标物M为正己醇，经标准品比对与以上结果一致。

图4 MassworksTM中的Mark an RT Window选取色谱峰扫描范围Fig.4 Peak scan range selected by MassworksTM RT Window in Massworks

2.3.4羊油香气成分的分析 应用TD-GC/MS采集羊油香气的总离子流图(TIC)示于图6。采用NIST11谱库进行检索，实现样品组分的初步分析，再通过MassworksTM质谱解析软件对羊油香气原始扫描总离子流图进行校正，利用CLIPs功能获取精确分子质量、质量误差与谱图精度，分析结果列于表3。

从羊油的整体香气组成类别来看，烃类化合物占比重最大，为36%；醛类化合物次之，为33%；醇类化合物占9.5%；酮类化合物占7%；醚类、酯类以及杂类化合物各占4.83%。

对羊腰部、羊尾部的羊油样品进行分析，发现2个部位的羊油香气成分含量具有很大的差异。羊腰部羊油中正己醛占比最大，为19.49%，具有青草的香气[24]；壬醛次之，占11.25%，具有油脂香[25]。羊尾部羊油中壬醛占比最大，为20.96%；3-羟基-2-丁酮次之，为20.01%；具有奶油的香味。本实验结果与文献报道[26]的羊肉中挥发性风味物质类型的含量有一定差异。这可为进一步分析羊油香气中不同阈值的化学成分提供更多信息。

表2 C6H14O的碎片离子MassworksTM分析结果Table 2 MassworksTM analysis results of C6H14O fragment ions

图5 MassworksTM中碎片离子峰形图Fig.5 Fragment ions in MassworksTM

图6 羊油香气成分总离子流图Fig.6 Total ion chromatogram of aroma components of sheep oil

峰号No.保留时间tR/min分子式Formula化合物Compound精确分子质量Exactmass质量误差Masserror/mu谱图精度Spectralaccuracy正反匹配度Match/R.Match)羊腰部含量Relativecontent ofsheepwaist/%羊尾部含量Relativecontent ofsheeptail/%17.364C8H18正辛烷114.1403-6.802098.9887914/9164.319.6029.963C5H10O异戊醛86.0726-13.516499.4756857/8950.510.10310.897C6H8O反,反-2,4-己二烯醛96.05709.833799.2069756/8410.400.23411.100C8H18O二丁醚130.1352-9.716693.5050825/8501.260.07511.675C4H6O22,3-丁二酮86.0362-0.130999.7506849/9290.850.19611.957C5H10O戊醛86.0726-33.916499.2560908/9224.341.32712.849C10H203,7-二甲基-2-辛烯140.1560-8.452198.8081889/8990.860.12814.562C7H8甲苯92.062114.648399.0635925/9323.544.11916.424C6H12O正己醛100.088-15.86697.271945/96819.497.831019.023C8H10乙基苯106.0777-5.701799.9724907/9270.633.951119.263C5H8O反式-2-戊烯醛84.0570-6.166398.9270914/9190.720.011219.532C8H10间二甲苯106.0777-1.201798.8303925/9260.265.461319.928C8H10对二甲苯106.07776.798399.1133788/9211.622.401420.473C10H16β-蒎烯136.1247-9.751997.5418795/8050.190.021522.024C12H26十三烷170.2029-77.002399.3703806/8460.450.151622.233C7H14O庚醛114.1039-5.716597.6123951/9524.021.951723.174C10H16(+)-柠檬烯136.12470.048198.8403923/9282.720.281824.814C9H14O2-正戊基呋喃138.103910.683599.9265859/8652.366.681925.683C5H12O正戊醇88.0883∗∗910/9202.331.252026.102C10H16(1S,3R)-顺式-4-蒈烯136.1247-26.451998.9789777/8370.490.042127.150C8H8苯乙烯104.062119.248399.5110931/9323.960.24

续表3

注：*表示未检出

3 结论

通过MassworksTM质谱解析软件对背景扣除、共流出化合物判别、离子碎片信息检索，分析得出羊油的香气成分中含有15种烃类、14种醛类、4种醇类、3种酮类、2种脂类、2种醚类和2种其他物质。该方法从多角度对羊油香气成分进行定性，解决了天然产物香气成分定性的不确定性与单一性。通过对羊油的香气成分进行准确定性，可为羊油的食用以及香气成分的分离提供参考。