苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白定量检测方法分析

金海燕 胡凌云 刘荷梅

摘要：为完善苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringrensis subsp. israelensis）毒素蛋白定量检测方法，试验用一定浓度的磷酸缓冲溶液、纯化水洗涤苏云金芽孢杆菌以色列亚种试样，去除培养基残留。用SDS-PAGE电泳法检测离心后收集到的试样菌体毒素蛋白含量。结果表明，通过磷酸缓冲液及水洗涤试样，解决了试样中杂质干扰毒素蛋白含量检测的关键性问题，采用该方法能够准确对苏云金芽孢杆菌以色列亚种两种主要相对分子质量的毒素蛋白进行检测与定量，且重复性好，检测误差可以控制在5%以内，并且检测结果与产品生物效价存在显著相关性。

关键词：苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringrensis subsp. israelensis）；毒素蛋白；SDS-PAGE凝胶；电泳

中图分类号：TQ453.5；O657.8 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）03-0096-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.03.026 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： To provide a quantitative detection method for toxin protein of Bacillus thuringrensis subsp. israelensis （Bti），and to improve the quality control technique. The samples of Bacillus thuringrensis subsp. israelensis were washed in water with a certain concentration of phosphoric acid buffer solution， and the residue of culture medium was removed. The bacterial toxin protein collected after centrifugation was detected by SDS-PAGE electrophoresis and the content was determined. The key problem of the determination of impurity interfering toxin protein in the sample was solved by washing the sample with phosphoric acid buffer and water. This method can accurately detect and quantify the two major molecular weight toxin proteins of Bacillus thuringrensis subsp. israelensis. The method was used to detect the subspecies of Bacillus thuringrensis subsp. israelensis. The results were reproducible， the detection error could be controlled within 5% of the average value， and there was a significant correlation between the detection results and the biological titer of the products. The method is reasonable in conception and simple in operation， and can provide reference for further product quality management.

Key words： Bacillus thuringrensis subsp. israelensis； toxin protein； SDS-PAGE gel； electrophoresis

蚊類是“四害”之一，目前世界上已知的有3 200余种，中国记载已达360多种。蚊虫不仅叮咬人和动物，还传播疟疾、登革热病、流行性乙肝病、淋巴丝虫病、黄热病等流行疾病[1-6]。据统计，全球每年有5亿人被按蚊传播的疟疾感染，其中200万是非洲儿童；非洲、亚洲、中南美洲，这些地区每年至少100万人死于登革热，1万人死于黄热病[7]。此外有些伊蚊将嗜睡性脑炎病毒传染给人类，每年致使约3万人丧命。苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringrensis subsp. israelensis，简称Bti）具有很强的杀幼蚊活性[8]，对非靶标生物安全，是目前用于蚊虫防治的重要微生物菌株[9]。目前，这种细菌的应用范围进一步扩大，Bti作为生物制剂广泛应用于控制各种作物和森林、果树、蔬菜、茶叶害虫[10]。在Bti类产品生产与流通过程中，需要对产品进行产品质量检测与控制，然而国内目前尚未有针对Bti类产品质量的检测标准，因此需要针对Bti类产品质量检测方法进行研究。

Bti杀幼蚊产品的主要有效成分是由杀虫蛋白组成的伴孢晶体。当幼蚊取食伴孢晶体后，晶体首先在碱性肠道内溶解释放原毒素，进一步经蛋白质水解酶作用形成活化毒素片段。毒素随后与中肠上皮细胞作用，导致肠上皮细胞穿孔、肿胀并裂解，最终导致幼虫死亡[11，12]。目前最常用的Bti杀幼蚊产品检测方法是生物测定[13]，世界卫生组织（WHO）对Bti生物测定制定了相应的标准，规定了供试昆虫为埃及伊蚊[14，15]，同时也有用摇蚊[16，17]、中华按蚊[18]、三带喙库蚊[19]等作为供试昆虫测其毒力效价的报道。但生物测定受靶标昆虫质量、数量及外界条件等影响，检测误差较高，因此，需要建立更可靠的检测方法。Bt杀虫剂的主要杀虫成分是杀虫蛋白，中国国标与化工行业标准均采用SDS-PAGE凝胶电泳的方法测定Bt类产品的晶体蛋白含量。本研究在前期生产中发现按照Bt 16 000 IU/mg可湿性粉剂标准（HG 3617-1999）中毒素蛋白检测方法难以检测Bti杀幼蚊产品的杀虫蛋白含量。本研究参考Bt 16 000 IU/mg可湿性粉剂标准（HG 3617-1999）中毒素蛋白检测方法，针对Bti杀幼蚊产品进行了方法改进，建立适合Bti杀幼蚊产品的检测方法。并且分析了不同发酵批次产品的杀虫蛋白含量与杀虫效价的关系，杀虫蛋白含量与杀虫效价有显著相关性。相关研究结果不仅可以指导Bti类产品的生产过程，更好地控制Bti类产品的质量，还可以为进一步制定Bti类生物农药质量标准提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

四甲基乙二胺（TMED），分析纯；0.55 mol/L氢氧化钠溶液；10%过硫酸铵溶液（10%AP）；10%十二烷基硫酸钠溶液（10% SDS）。

0.1 mo1/L磷酸缓冲液（pH 8.0）：称取1.77 g无水磷酸氢二钾至250 mL烧杯中，加入0.1 mol/L无水磷酸二氢钾溶液6 mL（13.61 g磷酸二氢钾溶解至1 000 mL水中），加水溶解，转移至100 mL容量瓶，加水定容。

30%丙烯酰胺母液（30% ACR-BIS）：称取丙烯酰胺（ACR）29.0 g、亚甲基双丙烯酰胺（BIS）1.0 g，溶于100 mL水中，中速定性滤纸过滤，于4 ℃暗处贮存备用。

pH 8.8分离胶缓冲溶液：称取三羟基甲基氨基甲烷（Tris）30.25 g，溶于水中，用浓盐酸调至pH 8.8，用水定容至250 mL。

pH 6.8浓缩胶缓冲溶液：称取三羟基氨基甲烷（Tris）12.10 g，溶于水中，用浓盐酸调至pH 6.8，用水定容至100 mL。

pH 8.3电极缓冲溶液：称取三羟基甲基氨基甲烷（Tris）3.03 g，甘氨酸14.42 g，十二烷基硫酸钠（SDS）1.0 g，溶于水中，用浓盐酸调至pH 8.3，用水定容至1 000 mL。

样品稀释液：1 mol/L pH 6.8浓缩胶缓冲液18.75 mL，十二烷基硫酸钠6.0 g，甘油30 mL，巯基乙醇15 mL，少许溴酚蓝，用水定容至100 mL。

染色液：称取考马斯亮蓝（CBB）R-250 1.0 g，加入甲醇450 mL、冰乙酸100 mL、水450 mL，溶解混匀，过滤备用。

脱色液：量取甲醇100 mL、冰乙酸35 mL于1 000 mL容量瓶中，加水定容。

漂洗液：量取无水乙醇300 mL、冰乙酸100 mL、水600 mL，混匀。

固定液：量取75 mL冰乙酸于1 000 mL容量瓶中，加水定容。

毒素蛋白标准品：毒素蛋白（相对分子质量为130 ku）含量为11.7%，由美国CY公司提供。

1.2 仪器

垂直电泳仪，直流电源；夹芯式垂直电泳槽；灌胶模具；10.5 cm×10.0 cm玻璃板2套；10孔样品梳1把。电泳凝胶成像系统；离心机，最高转速16 000 r/min。微量进样器；1 000、200、20、10 μL（尖头）各1支；电子天平。

1.3 标样溶液的配制

称取毒素蛋白标准品45.00 mg（精确至0.01 mg）于10 mL离心管中，加5 mL水，充分混匀。移取0.5 mL至1.5 mL EP管中，加入0.55 mol/L氢氧化钠溶液0.125 mL，混匀，静置5 min，再加入样品稀释液0.325 mL，总体积为0.95 mL，混匀后于沸水浴中煮6 min，冷却至室温，7 000 r/min离心15 min，取上层清液，以备电泳上样。

1.4 Bti试样前处理

1.4.1 称样 称取Bti试样30 mg（精确至0.01 mg，根据试样128 ku与65 ku毒素蛋白含量称取适量试样，使处理后试样溶液中128 ku与65 ku毒素蛋白含量均在0.2～0.8 mg/mL）于1.5 mL离心管中。

1.4.2 干扰物质的消除 加入1.3 mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH 8.0），混匀，15 000 r/min离心2 min，弃去上层清液。再加入1.3 mL水，混匀，15 000 r/min离心2 min，弃去上层清液。

1.4.3 试样处理 向收集到的菌泥中加入0.5 mL水，充分混匀，加入0.125 mL 0.55 mol/L氢氧化钠溶液，混匀，静置5 min。再加入样品稀释液0.325 mL，混匀。于沸水浴中煮6 min，冷却至室温，7 000 r/min离心15 min，取上层清液，以备电泳上样。

1.5 SDS-PAGE电泳

1.5.1 聚丙烯酰胺凝胶制备 按表1配方分别配制分离胶与浓缩胶。先配制分离胶，最后加入适量TMED（室温高，TMED可适量减少，确保胶凝固时间在30～40 min），混匀后迅速倒入灌胶模具中，液面距凹槽玻璃板顶端3 cm左右，然后轻轻加入1 mL水至胶液面，注意不要扰乱液面。待胶凝固后，倒出水，用滤纸条吸干残余水。将表1配制的浓缩胶混匀后迅速倒入分离胶上面，液面至凹槽玻璃板顶端，迅速插上10孔样品梳。

1.5.2 进样 将凝胶模具放入电泳槽中，打开凝胶模具下方密封口，并向陰、阳两极槽注入适量pH 8.3电极缓冲液，阴极槽加满，阳极槽中电极缓冲液没过电泳模具下封口即可。小心取出凝胶中的梳子，用10 μL尖头微量进样器分别吸取10、8、6、4、2 μL上述标样溶液上清液注入到不同的进样孔中，再吸取6 μL试样溶液上清液注入到试样进样孔中。盖上电泳槽盖，接通电源。

1.5.3 电泳 调节电泳仪电源电压至100 V、电流50 mA。待溴酚蓝指示剂前沿离开浓缩胶，进入分离胶后，调节电泳仪电源电压至120 V。待溴酚蓝指示剂前沿距胶边1 cm左右时停止电泳。取出胶片，用样品梳刀切去浓缩胶，小心将分离胶剥离至玻璃培养皿中。

1.5.4 固定 用7.5%乙酸将电泳后的分离胶片浸泡30 min以上。

1.5.5 染色 用考马斯亮蓝染色液染色4 h以上。

1.5.6 漂洗、脱色 先用漂洗液漂洗20 min左右，再用脱色液脱色至背景清晰为止。

1.6 成像及数据处理

1.6.1 凝胶成像 胶片经脱色处理后，用电泳凝胶成像系统将凝胶成像，并将图像文件保存于电脑。

1.6.2 数据处理 用Labscan 5.0软件对蛋白带进行图像分析。毒素蛋白标准品中130 ku毒素蛋白含量为11.7%，标样溶液进样量为10、8、6、4、2 μL，根据标准品称样量与处理后最终体积计算出进样毒素蛋白质量依次为5.54、4.43、3.32、2.22、1.11 μg。以标样溶液130 ku进样毒素蛋白质量为横坐标，相应的蛋白带强度值为纵坐标，用最小二乘法作回归方程，得到标准曲线y=ax+b。软件自动按试样溶液蛋白带强度值计算出进样试样中128 ku与65 ku毒素蛋白的质量。试样中两种主要分子量（128、65 ku）毒素蛋白质量分数W，按以下公式计算。

式中，m为称取试样质量，mg；V1为注入凝胶上样孔的试样溶液体积，μL；m1为从标准曲线上查得的试样溶液中毒素蛋白的质量，μg；V2为试样最终定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 Bti试样预处理

Bti试样中存在一些培养基残余物，有些物质阻止了毒素蛋白与SDS形成毒素蛋白-SDS复合物，导致无法准确检测出试样中的毒素蛋白含量。采用表2的方法对Bti原粉（批号20170214）进行不同的预处理，预处理后15 000 r/min离心2 min，弃去上层清液，收集菌泥。然后参照Bt 1600WP HG3617-1999标准中毒素蛋白检测方法检测收集到的菌泥或菌粉毒素蛋白含量。不同预处理方法处理试样后电泳见图1，检测结果见表2。由表2可知，针对同一批Bti原粉，不同的称样质量，试样不作预处理，按照Bt 16 000 IU/mg WP标准HG3617-1999中毒素蛋白检测方法检测其毒素蛋白含量，结果无法准确定量，甚至不出现特征蛋白带现象；针对同一批Bti原粉，水洗前后比较，水洗后检测结果升高，水洗1次与多次结果相近；用0.1 mol/L磷酸缓冲液及水洗涤试样，结果高于用0.1 mol/L HCl与水洗涤试样，且胶片脱色后背景清晰。

用1.3 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液洗试样1次，15 000 r/min离心2 min，弃去上层清液，然后用水洗试样1次，15 000 r/min离心2 min，弃去上层清液，收集菌泥。该方法基本可消除试样中的一些残余物质对毒素蛋白定量检测的干扰。

2.2 线性关系考察

称取不同质量的Bti原粉（批号20170214，128 ku毒素蛋白含量为2.25%，65 ku毒素蛋白含量为1.65%），按上述方法七对试样进行预处理，电泳结果见图2、表3。128 ku晶体蛋白-蛋白带强度回归方程见图3，65 ku晶体蛋白-蛋白带强度回归方程见图4。运用该方法对Bti试样处理后，试样称样量在10～50 mg（进样晶体蛋白质量在1.0～5.0 μg），进样、电泳、脱色处理后，胶片中128 ku毒素蛋白质量与其蛋白带强度的回归方程为y=1 460.5x+690.21，R2为0.995 6；65 ku毒素蛋白质量与其蛋白带强度的回归方程为y=1 408.5x+1 002.2，R2为0.993 9。两种主要晶体蛋白质量与相应的蛋白带强度线性关系良好，符合方法线性关系要求。

2.3 方法重复性

分同时同一块胶与不同时间不同胶分别考察该方法的重复性。称取不同质量的试样Bti原粉（批号20170215），检测其毒素蛋白含量，检测结果见表4。由表4可知，128 ku毒素蛋白含量平均值为1.64%，变异系数2.67%；65 ku毒素蛋白含量平均值2.19%，变异系数2.21%；不同时间检测Bti原粉两种主要晶体蛋白含量，相对误差可以控制在平均值的5%以内。

2.4 杀虫蛋白与生物效价相关性考察

以4龄库蚊幼虫为靶标昆虫，以Bti IPS82（1 884菌株）为标准品，毒力效价为15 000 ITU/mg，分别称取适量标准品与Bti试样，用水稀释得到6个稀释浓度分别为0.06、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01 mg/L的感染液，每种感染液为150 mL。向不同浓度的标样溶液与试样溶液各放入25×2头4龄库蚊幼虫。所有试蚊在（25±2） ℃的温度下饲养24 h后检查死亡情况。计算标样和试样各浓度供试蚊死亡率，以水作空白对照，对死亡率进行校正。校正死亡率（X1）计算公式如下。

将感染液各浓度值换算成常用对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用最小二乘法作回归方程，根据回归方程分别求出标样LC50值和待测试样LC50值。待测试样的毒力效价（X2）计算公式如下。

对近期生产的60批Bti原粉分别进行毒素蛋白（128 ku与65 ku）含量与生物效价（Culex）测定，将Bti原粉生物效价与毒素蛋白（128 ku+65 ku）含量数据绘制成散点图（图5）。散点图中数据分布顯示出生物效价与毒素蛋白有一定的相关性。进一步运用SPSS软件对数据进行双变量相关性分析，结果显示生物效价与毒素蛋白含量在0.01水平（双侧）上显著相关，相关系数为0.569。

3 讨论

随着经济与社会发展，人们对环境保护的需求越来越高，采用环境安全的杀虫剂进行害虫控制已经成为生产生活中的重要选择。苏云金芽孢杆菌（Bt）类是一种对多种农业害虫具有毒杀作用的微生物杀虫剂，具有杀虫高效、对人类和其他生物安全的特点[20]。苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bti）药剂主要以库蚊幼虫或伊蚊幼虫作为靶标昆虫检测其毒力效价，因其个体差异大、受外界环境影响大等多方面原因导致生物检测误差大、耗时长[13]。因此在相关产品的生产与应用过程中需要更可靠的质量检测技术，来控制生产与贮存过程中的产品质量。苏云金芽孢杆菌类药剂生物效价效用物质有杀虫蛋白形成的伴孢晶体、苏云金素、芽孢、肠毒素、双效菌素（ZwA）等，其中起主要作用的是伴孢晶体[21，22]。因此，本研究对Bti产品中伴孢晶体蛋白含量进行检测，并分析其与产品生物效价的相关性，可以为进一步制定基于杀虫蛋白含量的产品质量控制检测技术奠定基础。

中国国标和化工部标准中对Bt产品中毒素蛋白的定量检测有明确阐述，但是在前期生产中发现按照Bt 16 000 IU/mg可湿性粉剂标准（HG 3617-1999）中毒素蛋白检测方法难以检测Bti杀幼蚊产品的杀虫蛋白含量，推测由于Bti产品发酵采用培养基与该标准所涉及产品不同，产品中培养基残留成分对蛋白质电泳产生了影响。因此本研究以Bt 16 000 IU/mg可湿性粉剂标准（HG 3617-1999）中毒素蛋白检测方法为基础，针对Bti杀幼蚊产品进行方法改进，解决晶体蛋白难以检测的问题。利用改进的方法，可以通过SDS-PAGE凝胶准确测定产品中两种主要晶体蛋白（128 ku、65 ku）含量，并且定量结果与杀虫效价有显著相关性。

本研究针对Bti产品改进的晶体蛋白检测定量技术，不仅可以从生物效价与晶体蛋白两方面检测Bti类产品的品质，指导Bti类产品的生产过程管理，更好地控制Bti类产品的质量，还可为进一步制定Bti类生物农药质量标准提供技术参考。

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