miR-18a表达在HPV感染及宫颈癌发生发展中的意义

危 敏，余海浪，王涵多，雷 洁，韩璐好

(1.深圳市南山区妇幼保健院检验科遗传室，广东 深圳 518054；2.南方医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，广东 广州 510515)

宫颈癌是女性高发的恶性肿瘤，其发生一般需经历从正常宫颈上皮到不同级别癌前病变的过程，平均需要5～20年。高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)持续感染是宫颈癌的主要危险因素，90%以上的宫颈癌伴有HR-HPV感染[1]。

microRNA(miRNAs)是一类长度为19～25个核苷酸的内源性非编码RNA，在转录后水平(RNA切割或翻译抑制)负性调控靶基因的表达[2]。越来越多的研究显示miRNAs在肿瘤的发生、侵袭、转移和复发等过程中扮演着重要角色，并与其预后密切相关。人类血清或血浆中存在一些稳定性良好的循环miRNAs，并且正常人和不同类型肿瘤患者体内循环miRNAs的表达谱存在显著差异[3-4]。此外，HPV感染阳性妇女的宫颈脱落细胞中miRNAs检测对肿瘤早期诊断、分期和预后评估等方面也可能具有重要的作用[5]。因此，患者血清中及宫颈脱落细胞中异常表达的miRNAs可作为宫颈癌无创诊断和预后判断的生物标志物，从而早期诊断宫颈癌，减少肿瘤的转移和复发，为宫颈癌的诊疗提供突破点。

miR-18a可能作为癌基因在肿瘤发生中发挥重要的调控机制，其表达水平在乳腺癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、鼻咽癌、神经胶质瘤等肿瘤中显著增高[6-7]，尤其在患者血清中可以检测到高水平的miR-18a，提示该分子有希望作为一种新型肿瘤标志物用于肿瘤的无创性早期诊断，但其与宫颈癌的相关关系，目前未见文献报道。

我们在前期研究中通过临床组织标本检测发现miR-18a表达水平在宫颈癌组织中明显高于癌旁正常组织，基于此基础，本实验通过检测宫颈脱落细胞中miR-18a表达与HPV感染之间的关系，以及HR-HPV感染的宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌病变不同阶段miR-18a表达，初步探讨miR-18a表达在HPV感染及宫颈癌发生发展中的意义。

1资料与方法

1.1标本来源

收集2015年6月至2017年6月深圳市南山区妇幼保健院及广州南方医院门诊及住院患者宫颈脱落细胞标本，将细胞刷放入Preserv Cyt细胞保存液中和用于HPV DNA检测的保存液中保存，置于4℃冰箱。通过HPV分型检测将宫颈脱落细胞分为HPV未感染组(NE-HPV)、低危型HPV感染组(LR-HPV)、高危型HPV感染组(HR-HPV)。

选取HR-HPV检验阳性标本，经病理学证实为宫颈癌(30例)和CIN(30例)，对照组选取年龄、体重配对的30例经液基细胞学检查证实为宫颈上皮细胞正常无化生的女性，留取宫颈脱落细胞标本冻存。所有受试者均对本研究知情同意，本研究通过医院伦理委员会批准进行。

1.2实验方法

1.2.1 HPV DNA基因型检测

取宫颈脱落细胞样本保存液500μL，14 000r/min离心1min后弃上清，严格按照试剂盒(深圳亚能公司)操作说明进行提取。采用核酸分子快速杂交仪及配套试剂盒，应用标记有23种HPV基因型别寡核苷酸探针的低密度基因芯片杂交膜(18种高危型别：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83；5种低危型别：6、11、42、43、44)，按照试剂盒说明进行杂交，酶标显色。结果判断：阳性结果可出现清晰的蓝紫色斑点，根据不同型别HPV探针在膜上的具体位置，即可判断感染HPV类型。

1.2.2总RNA提取和反转录反应

取宫颈脱落细胞样本保存液500μL，采用miRCURYTM RNA提取试剂盒(日本Takara公司)提取总RNA，Nano-drop 2000分光光度计(美国Thermo公司)检测总RNA的纯度与浓度。反转录反应采用Mir-XTMmiRNA First Strand Kit试剂盒(日本Takara公司)将提取的总RNA反转录成cDNA，具体操作参照试剂盒使用说明。

1.2.3实时荧光定量PCR法检测miR-18a表达

采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction， rt-qPCR)检测宫颈脱落细胞标本中miR-18a表达水平。qPCR反应试剂盒SYBR Premix EX TaqTMⅡ购自日本Takara公司，具体步骤参照试剂盒说明书，以U6 snRNA为内参照，所有反应均在ABI 7500定量PCR分析仪(美国ABI公司)上进行。反应条件为：50℃激活聚合酶2min，95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火/延伸1min，扩增40个循环，结束后通过95℃ 15s，60℃ 1min，85℃ 15s，60℃ 15s制作溶解曲线。每个样本设3个复孔，计算3个复孔的平均Ct值为最终Ct值，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对含量。引物由上海Invitrogen公司合成。U6 snRNA上游引物为5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-18a上游引物为5′-TAAGGTGCATC￣TAGTGCA￣GATAG-3′；下游通用引物由反转录试剂盒Mir-XTMmiRNA First Strand Kit提供(日本Takara公司)。

1.3统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，所得数据以均数±标准差表示，各组间比较采用独立样本t检验，ROC曲线评估组织miR-18a作为宫颈癌/CIN标志物的诊断价值。采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1宫颈脱落细胞HPV DNA基因型检测

如图1所示，阳性结果可出现清晰的蓝紫色斑点，病例3显示为高危型HPV68型感染；病例6显示为HPV11、16、42、52、59型混合感染；病例10显示为高危型HPV51型感染。

图1宫颈脱落细胞HPV DNA基因型检测

Fig.1 Detection of HPV DNA genotype in cervical exfoliated cells

2.2宫颈脱落细胞中miR-18a表达情况

以ΔCT表示目的基因的表达水平，即ΔCT=目的基因CT值-内参基因CT值。图2显示NE-HPV组、LR-HPV感染组、HR-HPV感染组的宫颈脱落细胞中miR-18a表达水平分别为1.29±0.15、1.72±0.47、3.48±0.71，HR-HPV感染组miR-18a表达显著高于LR-HPV感染组和NE-HPV组(t值分别为11.144、18.482，均P<0.05)，而LR-HPV感染组和NE-HPV组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图2不同HPV感染组中宫颈脱落细胞miR-18a的表达

Fig.2 Expression of miR-18a in cervical exfoliated cells of different HPV infection groups

2.3宫颈癌、CIN与对照组宫颈脱落细胞中miR-18a的表达情况

图3显示宫颈脱落细胞中，宫颈癌组、CIN组中miR-18a表达水平分别为4.01±0.57、3.22±0.65，较对照组的1.27±0.16呈显著增高(t值分别为25.02、15.36，均P<0.05)，但宫颈癌组与CIN组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：NE为对照组。

图3宫颈癌组、CIN组与对照组宫颈脱落细胞中miR-18a的表达

Fig.3 Expression of miR-18a in cervical epithelial cells of cervical cancer group, CIN group and control group

2.4宫颈癌及CIN宫颈脱落细胞中miR-18a的ROC曲线分析

宫颈脱落细胞中miR-18a用于CIN的AUC为0.699，95%置信区间(CI)为0.606～0.791，最优截断值取0.317，诊断灵敏度为83.3%，特异度为73.6%，P<0.001；用于诊断宫颈癌的AUC为0.801，95%CI为0.724～0.879，最优截断值取0.483，诊断灵敏度为86.7%，特异度为82.3%，P<0.001，提示宫颈脱落细胞中miR-18a对CIN和宫颈癌具有良好的诊断价值，见图4。

图4宫颈脱落细胞中miR-18a表达对CIN(A)和宫颈癌(B)诊断价值的ROC曲线分析

Fig.4 ROC curve analysis of miR-18a expression in cervical exfoliated cells diagnosis of CIN (A) and cervical cancer (B)

3讨论

3.1 miRNA可作为高危型HPV感染及宫颈癌发生发展的分子标志物

宫颈癌是目前唯一被世界卫生组织确定为可以通过筛查降低浸润癌发生率的恶性肿瘤。高危型HPV检测和宫颈细胞学检查是目前最主要的两种宫颈癌筛查方法。HPV检测具有敏感性高、阴性预测值高、结果客观可靠等优点，但其最大局限性是阳性预测值低，在HPV检测结果为阳性的大量人群中，实际发生或将发生CIN或宫颈癌的患者很少[8]。HPV检测的目的不是筛查HPV感染，而是筛查出高度病变风险的人群[9]，因此，发现与高危型HPV感染及HPV诱导的宫颈病变发展(尤其是宫颈癌)密切有关的分子标记物，对于宫颈癌的早期诊断和预警极为重要。

miRNAs可稳定存在于各种体液中，包括血液、尿液、唾液、分泌物、眼泪、乳汁、支气管灌洗液、精液、羊水、胸水、腹水、脑脊液等[10]。因此，越来越多的研究致力于将miRNAs作为生物标记物用于疾病的早期临床诊断。相对于血清标本，宫颈黏液脱落细胞标本来源于宫颈，因此其对宫颈癌更具有特异性。同时，它具备无创、易于取样、易于检测等优点，因此宫颈黏液脱落细胞标本中的miRNA可成为早期宫颈癌筛查良好的生物标志物。

3.2 miR-18a通过调控多种靶基因参与调控肿瘤的发生发展

miR-18a来源于miR-17-92基因簇，位于人染色体13q31.3，通过调控多种靶基因参与调控肿瘤的发生发展[11]。有关miR-18a在肿瘤中的作用，有研究认为其可能作为抑癌基因发挥作用，通过调控其下游靶基因K-Ras对肿瘤细胞体外增殖发挥抑制作用，诱导G1期阻滞，促进细胞凋亡，降低肿瘤细胞的转移[12-13]。而相反研究结果表明在乳腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤等多种肿瘤中，miR-18a的表达上调。上调的miR-18a通过PTEN-PI3K-AKT-mTOR活化cylinD1促进食管癌细胞的增殖[14]。高表达的miR-18a与鼻咽癌的分期、淋巴结转移情况密切相关[15]。

3.3 miR-18a表达增高可能参与HPV介导的子宫颈癌的发病机制

我们也在前期预实验中发现miR-18a表达在大多数宫颈癌组织中明显高于正常组织，本研究结果显示，宫颈脱落细胞中miR-18a表达水平在HR-HPV感染组显著高于LR-HPV感染组及NE-HPV组，而LR-HPV感染组与NE-HPV组间未显示出显著差异，提示miR-18a表达水平的增高参与了高危型HPV的感染及对子宫颈癌变的致病过程，具体机制还有待研究。在高危HPV感染的宫颈脱落细胞中，CIN(包括CIN1～3级)及子宫颈癌组中miR-18a水平显著高于对照组，提示miR-18a表达水平增高可能参与了HPV介导的子宫颈癌的发病机制，并可能直接参与从病毒感染的初始阶段向癌前病变及子宫颈癌阶段的恶性转化过程。miR-18a表达水平在宫颈癌组、CIN组中并无显著性差异，提示一旦发展为癌前病变后，miR-18a表达水平与宫颈癌的发生发展并没有显著关联，但miR-18a和宫颈癌病理学不同发展阶段的相关性有待大样本的进一步研究证实。ROC曲线结果分析miR-18a用于诊断CIN的AUC为0.699，诊断灵敏度为83.3%，特异度为73.6%；用于诊断宫颈癌的AUC为0.801，诊断灵敏度为86.7%，特异度为82.3%，提示宫颈脱落细胞中miR-18a对CIN及宫颈癌具有良好的诊断价值，且宫颈脱落细胞标本易于获得，具备早期无创、特异性好等优点，有望成为早期宫颈癌筛查良好的生物标志物。