肿瘤血管生成拟态的分子病理和影像学研究进展

刘巧遇 综述 李若坤， 强金伟 审校

血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)的概念由美国病理学家Maniotis于1999年首次提出，指肿瘤细胞通过自身塑形获得内皮细胞特性，形成可传输血液的管道样结构，是独立于内皮依赖性血管(endothelium-dependent vessel)的肿瘤微循环模式[1]。VM管壁由肿瘤细胞直接围绕形成，管腔无内皮细胞衬覆，腔外无炎性细胞浸润及坏死，腔内极少形成血栓[2-4]。VM广泛存在于黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤中。本文就VM的影像学研究进展进行综述。

VM的发生机制

VM的形成与以下多种机制相关：①肿瘤微环境。肿瘤的快速生长和血供不足可导致微环境缺氧，可使缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)1α高表达[5]。Zhu等[6]将2种卵巢癌细胞三维培养于缺氧和正常氧环境中，置于缺氧环境的卵巢癌细胞HIF-1αmRNA明显高表达，形成VM。Su等[7]研究发现HIF-1α的抑制剂雷帕霉素可阻止卵巢癌细胞形成VM。②肿瘤细胞的“可塑性”。Mourad-Zeidan等[8]发现高侵袭性黑色素瘤细胞能发生表型改变，呈现出多潜能胚胎干细胞的属性，从而形成VM。膀胱癌细胞在三维培养下可形成网状类血管结构，模拟内皮细胞形成肿瘤微循环结构[9]。目前研究表明可形成VM的神经胶质瘤细胞同时也具有某些干细胞特性，表现出多向分化的能力[10]。③VM形成分子机制。钙黏蛋白(VE-cadherin)是促进VM形成的重要因子之一，侵袭性黑色素瘤高表达VE-cadherin，而非侵袭性黑色素瘤阴性表达[11-12]。VE-cadherin是通过介导EphA2发挥作用[13]，EphA2与细胞膜表面配体互相作用使EphA2磷酸化，之后通过调节细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)激活磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3’-OH kinase,PI3-K),PI3K/Akt信号通过调节细胞膜I类基质金属蛋白酶(MT I-MMP)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和5层黏连蛋白γ 2链(Ln-5 γ 2)的裂解参与VM的形成。[14]。细胞组织因子(tissue factor,TF)、半乳凝素3(galectin 3,Gal-3)、环腺苷酸单磷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)及环氧酶2(cyclooxygenase 2,Cox2)均与VM的形成有重要关系[15]。

VM的形态学特征

VM是肿瘤细胞自身变形模拟血管内皮细胞与细胞外基质互相作用形成的类血管样结构，几乎只见于高度恶性的肿瘤。VM管壁由肿瘤细胞直接围绕形成，管腔无内皮细胞衬覆，腔外无炎性细胞浸润及坏死，腔内极少形成血栓，并少见红细胞漏出[16]。VM与内皮依赖性血管在免疫学和形态学上均存在明显差异。在免疫学上，VM细胞外基质富含层粘连蛋白、Ⅳ型和Ⅵ型胶原、黏多糖、硫酸肝素糖蛋白等成分，血管内皮标记物(CD31、CD34、VEGF等)染色阴性，过碘酸希夫(periodic acid-schiff stain,PAS)染色则呈阳性。在形态学上，VM特有的管腔结构面积是内皮依赖性血管的11.6倍，可为肿瘤获取更多营养；由肿瘤细胞和内皮细胞共同参与构成的血管称为马赛克血管，属于广义的VM范畴。在结直肠癌移植瘤中，马赛克血管直径10.8 μm ，占所有灌注血管的15%，马赛克区域约占所在血管周径的25%，占整个肿瘤血管总面积的4%，80%存在基底膜缺如[17,18]。

VM的病理生理学

VM是肿瘤组织内的一个功能性微循环，为肿瘤提供丰富的营养支持。Maniots等[1]研究葡萄膜黑色素瘤时发现直径>1cm的瘤体中央无坏死也无内皮依赖性血管存在的组织学依据，但可见大量PAS染色阳性的图案存在，并在该图案中见到红细胞串；经葡萄膜黑色素瘤患者的肘前静脉注入吲哚卡因绿，利用共聚焦激光显微镜可见吲哚卡因绿分布于该图案中。张诗武等[19]将活性炭注入恶性黑色素瘤小鼠模型体内，亦可见活性炭颗粒分布于VM结构和内皮依赖性血管中央，证实VM是肿瘤组织内的功能性微循环，这为影像学检查时对比剂的使用提供了组织学依据。

VM的临床意义

VM与肿瘤生物学行为密切相关。一方面，VM几乎只存在于高侵袭性恶性肿瘤，如黑色素瘤、胶质瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、肝癌、结直肠癌等；另一方面，VM丰富了肿瘤组织的血供，并且因无血管内皮的屏障作用，肿瘤细胞直接构成血管壁，更有利于肿瘤细胞的侵袭和转移。Wang等[20]对86例胶质瘤患者进行PAS、CD34检测，证实其中23例含VM血管，VM阳性患者的中位生存期(11.17个月)明显短于VM阴性患者(16.1个月)，差异有统计学意义(P=0.017)，表明VM可能是影响胶质瘤患者预后的独立因素。Shen等[21]发现乳腺癌中VM阳性率约为24%，VM阳性组较阴性组的肿瘤体积更大(>2 cm)(P=0.02)、淋巴结转移更常见(P=0.0005)、总体生存期更短(P=0.003)，表明VM与乳腺癌的高侵袭性、不良预后密切相关。Williamson等[22]对41例晚期小细胞肺癌患者进行研究，发现VM水平越高，总生存率越低(P<0.025)，并且VM可降低肿瘤潜伏期和顺铂的疗效。Chen等[23]对44例肝癌切除标本中VM与门静脉受侵的相关性进行分析，发现门静脉受侵患者中VM阳性率为72%，阴性率为15%，表明VM与门静脉受侵呈明显正相关(r=0.574,P<0.001)。牛多山等[24]发现，在156例结直肠腺癌中VM阳性率为20%，在低分化组、伴有血管及神经侵犯组、伴有淋巴结转移组中阳性率更高，说明VM形成与结直肠腺癌的侵袭或远处转移相关。VM的发现可能为肿瘤的治疗干预提供新的靶点，因此寻求一种能早期活体定量肿瘤VM存在及数目的技术方法对指导临床治疗具有重大意义。

VM的影像学评估

病理学免疫组化检查是评价VM的“金标准”，但因其有创性、存在取材误差等局限未能在临床上广泛运用。影像学是活体状态VM量化评估的重要方法，可显示瘤内微循环，为术前分级、预测靶向治疗疗效及预后提供依据，主要包括超声、MRI、分子成像、光学成像等。

1.超声

赵小琪等[25]利用超声造影即对比增强超声(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)对裸鼠卵巢癌移植瘤模型进行检测，比较不同时间点(21天、28天)肿瘤中VM密度、微血管密度(microvessel density,MVD)及超声造影参数[峰值强度(peak intensity,PI)、达峰时间(time to peak,TTP)、持续时间(time to duration,TTD)]的关系，发现21天组的PI与VM密度、MVD均呈正相关(r值分别为0.657、0.652，P值均<0.05)，28天组的PI与MVD呈正相关(r=0.687，P=0.03)。说明CEUS定量参数有助于评估卵巢癌不同生长时期的VM及MVD表达。Silverman等[26]发现肿瘤的转移与其特殊的细胞外基质模式相关，利用高频超声波对117例术前经病理证实存在特殊细胞外基质模式的黑色素瘤患者进行检查，得出其相关的声学后散射参数，利用标准波谱分析[分析标准为线性判别分析(LDA)和径向基函数网络(RBN)]，发现和散射浓度相关的特征与富含基质的模式的组织学存在相关，而这种模式又与葡萄膜黑色素瘤的转移风险有很强的相关性，故可根据肿瘤散射浓度的高低早期预测瘤体内是否存在VM，为临床治疗和疾病预后提供帮助。

2.MRI

动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI,DCE-MRI)可揭示肿瘤内血管分布状况，量化病变部位的血管生成，为临床提供病理生理学信息。龚威等[27]运用DCE-MRI评价兔VX2骨肿瘤抗血管生成疗效，发现实验组VX2骨肿瘤外周区域与中心区域的Ktrans值差异有统计学意义(P<0.05)；实验组治疗后肿瘤外周和中心区域的VEGF表达、MVD值与Ktrans值间均呈正相关关系(r值分别为0.924、0.945、0.848和0.909，P值均<0.05)，表明DCE-MRI可反映肿瘤血管的生成特点。Shirakawa等[28]利用可形成VM血管的WIBC-9肿瘤细胞(实验组)和MC-5肿瘤细胞(对照组)建立裸鼠乳腺癌模型，采用MRI大分子对比剂行多时间点MRI动态灌注增强扫描，发现对比剂到达WIBC-9瘤内的速度及浓聚速度快于MC-5组，WIBC-9瘤体表现为中央强化程度逐渐增强，且与肿瘤周边强化程度大体一致；对照组MC-5表现为中央无明显强化。病理上WIBC-9瘤体中央无血管内皮样结构，也无明显坏死及纤维化，电镜及免疫组化发现WIBC-9瘤体内存在VM-新生血管通路。以上研究结果表明DCE-MRI可检测炎性乳癌中VM血管的存在。

3.分子影像

分子影像学是将特异性分子探针导入体内，通过影像学技术显示组织、细胞及亚细胞水平的特定分子，反映活体状态下分子水平的变化，根据影像学参数对其生物学行为进行定量、定性分析。Fang等[29]于体外三维条件下培养HCCLM9细胞96h后，可见该细胞排列成基质骨架，通过细胞紧密连接形成管状、环形和网状结构，即VM，并且利用量子点分子成像可清晰显示VM。

4.光学成像

光学成像(fluorescence imaging,NIRF)是以特定波谱范围的激发光源照射荧光分子，被激发的荧光分子发出不同光谱特性的光子信号，此信号通过滤光片后由超敏照相机采集，然后通过高级数据处理技术将光子信号转换为图像。目前NIRF已较多地应用于肿瘤微血管生成研究[30]。Yang等[31]建立裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型，利用全身光学成像可清晰显示原位和转移瘤中微血管密度；将表达荧光蛋白的肺癌细胞注射入裸鼠爪垫，利用光学成像发现肿瘤微血管密度于10 d内直线上升；同样将绿色荧光蛋白阳性的人乳腺癌细胞移植入小鼠乳腺脂肪垫内，光学成像检测到肿瘤新生血管密度在20周内直线上升，表明光学成像可实时评估药物疗效和肿瘤新生血管的形成。Camorani等[32]发现抗表皮生长因子受体CL4抗体可通过阻碍整合素α的功能来抑制乳腺癌中VM的形成，注入特定的IntegriSense成像剂后，通过荧光分子断层摄影术(fluorescent molecular tomography,FMT)进行成像研究，CL4-处理组较对照组而言肿瘤中IntegriSense信号量减少了48%(P=0.0091)。

光学层析成像(optical tomography,OT)是根据生物组织对光的吸收分布反映组织结构的一种新兴的无创性成像方式。生物组织吸收光能量后产生超声波，不同组织产生不同强度的超声波，因此可以区分正常组织与病变组织。OT对氧化和脱氧血红蛋白、脂肪组织和水含量敏感性高，能够显示肿瘤血管生成的特点。Quiros-Gonzalez等[33]利用多光谱OT研究雌激素依赖性(MCF-7)与雌激素非依赖性(MDA-MB-231)原位乳腺癌移植瘤模型的血管特征，结果显示MCF-7肿瘤含有更多的CD31+/aSMA+的成熟血管，具有更高的VEGF和iNOS，NO血清水平增高，而MDA-MB-231肿瘤中更多见VM，表明OT可以敏感地鉴别乳腺癌血管表型的差异。

VM的发现丰富了人们对肿瘤微循环的认识，解释了部分抗肿瘤血管生成靶向药物疗效不佳的原因，为肿瘤的治疗提供了指导性意见。但关于VM还有很多问题需要研究探索，例如VM与肿瘤内皮依赖性血管怎样相互连接，两者是否有共同靶点，VM数量、结构与肿瘤恶性程度的具体关系。随着对VM的深入研究，其解剖、功能、调控机制及与肿瘤生物学行为的相关关系都会逐步明确。