自然流产的遗传学检测研究进展

刘祥举

自然流产（Spontaneous Abortion，SA）发病率占确诊妊娠案例的10%～15%，其病因复杂，相关研究认为遗传特别是染色体异常是导致SA的主要因素[1-2]。染色体异常包括染色体数目异常、结构异常、多倍体以及嵌合体等[3]。目前临床上染色体异常的遗传学检测方法包括G显带染色体核型分析、荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization，FISH）、荧光定量PCR（quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR）、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、染色体微芯片技术（chromosomal microarray，CMA）以及下一代测序技术（nextgeneration sequencing，NGS）等[4]。SA 能增加再次妊娠失败的发生率及其他妊娠合并症的发病率。采用合适的检测方法对染色体情况进行分析，阐明SA病因，对再次妊娠有重要的指导意义。因此，本文就SA的遗传学检测技术研究进展进行综述，旨在为临床选择合适的染色体异常检测方法提供参考。

1 自然流产概述

SA是产科最常见的妊娠合并症。据报道大约有10%～15%已确诊的妊娠会在妊娠20周前发生自然流产[1-5]。根据流产发生时间的不同，将孕12周前流产称为早期流产，孕12周及以后的自然流产称为晚期流产。根据流产次数将与同一性伴侣连续遭受2次或2次以上的自然流产称为复发性自然流产[6]。目前已知的自然流产诱发因素众多，涉及遗传、免疫、感染、内分泌、环境及其他未知因素等[7]。遗传因素中染色体异常是目前公认的导致SA的最主要因素，超过50%的SA是由染色体异常引起的[8]。染色体异常的类型有染色体数目异常、染色体结构异常、嵌合体及多倍体等。在SA病例中，染色体数目异常出现频率最高（高达90%），结构异常约占6%，其他嵌合体约占1-2%，而多倍体出现频率较低[9-10]。SA并发症众多，不利于孕妇的身心健康，且随着流产次数的增加，提升了再次妊娠流产的几率[11]。目前，对于遗传因素引起的SA尚无有效诊治方法。对流产物及孕妇夫妻双方进行染色体排查，并结合遗传咨询和辅助生殖手段，对再次妊娠的指导具有重要的意义。

2 自然流产的主要遗传学检测技术

染色体异常是SA的主要原因，其检测常通过采集流产组织、刮宫组织、引产组织等样品，从中挑取由受精卵发育成的胎儿、胚胎或绒毛等组织进行细胞培养或者DNA提取，采用分子生物学检测方法对其进行检测，通过对其染色体异常状况进行分析，再结合夫妻双方的遗传背景辅助分析发生SA的遗传因素，为后续的生育提供科学依据和合理指导。临床上常见的SA遗传学检测方法有以下几种。

2.1 G显带染色体核型分析

G显带染色体核型分析是流产物染色体检测的“金标准”[4]。该方法通过对流产物进行细胞培养后制备染色体标本，利用显微镜观察染色体数目及形态结构进而分析检测结果。核型分析技术优点在于能够检测染色体的数目异常（如三体、单体或多倍体）和5兆碱基（mega base，Mb）以上的结构异常（如易位、倒位）[12]，尤其是对染色体平衡易位的检测是其他分子生物学方法无法取代的。此外，G带带型的相对稳定也使得该技术仍在临床上应用最为普遍[13]。张建林、朱蕊等[2，14]通过对自然流产绒毛细胞培养及染色体核型分析证实了胚胎染色体异常是造成自然流产的重要原因；邱惠国、王瑾等[15-16]分别通过G显带染色体核型分析技术检测出了染色体数目异常、染色体结构异常（包括平衡易位、罗伯逊易位、倒位、插入和缺失等）及染色体多态性，证实染色体核型异常是导致不孕不育、SA的主要原因。由此可见，G显带核型分析技术可以检出多种染色体异常类型，为SA病因分析提供了全面指导，同时对流产夫妇双方的染色体核型辅助分析也为胚胎停育的病因分析提供了依据。G显带染色体核型分析技术虽然有其不可替代的优势，但该技术主要依赖于细胞培养，培养过程容易受到母体细胞污染，且在实际临床应用中常常出现因为所取流产物过于陈旧影响染色体的制备情况，进而影响检测结果；甚至因为其冗长的培养过程使检测周期可长达一个月，这些都在一定程度上限制了其在临床上的应用，同时也促进了其他分子生物学技术的诞生。

2.2 荧光原位杂交技术

核型分析技术的局限性使得FISH技术逐渐应用于流产物的检测。FISH技术是将荧光标记的已知核酸序列作为探针，与待检测染色体中的靶序列进行杂交，然后在荧光显微镜下观察荧光信号从而分析待测样本染色体情况[17]。该技术免去了细胞培养这一复杂且失败率高的步骤，从标本制备到患者拿到报告这一过程仅需24～48 h，极大程度地缩短了临床报告时间，这些优势在一定程度上弥补了G显带染色体核型分析技术的不足，使其在流产物的检测中得到一定程度的应用[4，17]。Leung 等[18]对大样本研究结果显示的极高成功率更是证实了FISH技术应用于流产物检测的可行性，国内近年来的研究也显示了该技术用于流产物检测的高成功率[19，20]，这些证据为FISH的临床应用提供了信心。然而，FISH技术的高成功率仅表现于对染色体数目异常的检测，其对染色体的结构异常亦无能为力。而且由于该技术探针的局限性，常常仅针对常见的已知染色体异常进行检测。综合其检测成功率、成本、操作及实验周期等因素，该技术目前在临床上仍有一定的应用比例。

2.3 荧光定量PCR

QF-PCR技术是采用多对经荧光标记的引物对染色体特异的多态性短串联重复序列（short tandem repeat，STR）进行PCR扩增，然后对PCR产物进行毛细管电泳，再根据引物荧光信号强度比较杂合性STR位点双峰的比值，进而诊断染色体数目。该技术在1993年首次应用于染色体异常的检测，因其报告时间短、自动化程度高、价格相对便宜，迅速在临床上得到广泛应用[21]。Coelho等[22]采用QF-PCR对130例流产样本的染色体异常检测结果（54.6%）显示了其与常规染色体核型分析结果（48%）的一致性，且检出8例（11.3%）多倍体亦与传统的细胞遗传学检测结果（12%）相符，证实了QF-PCR技术用于染色体非整倍体及多倍体检测的可靠性。此外，该技术还可以根据STR位点判断染色体的来源，排除母体污染情况，为下次妊娠提供更多的遗传咨询信息[23]。目前国内外已经有成熟的商品化试剂盒，如Aneufast、TrueScienceTMAneuploidy STR Kits以及达安基因自主研发生产的21三体和性染色体多倍体检测试剂盒等。然而，这些试剂盒都只对21、18、13及X和Y 5条染色体进行检测，并不能检测剩余染色体的数目异常，也不能检测染色体的结构异常，同时，尚未有基于中国人群STR位点的大样本研究数据，这也是目前QF-PCR多被应用于产前诊断的原因。

2.4 多重连接探针扩增技术

2002年，Schouten 等[24]报道了一种可于同一反应管中同时检测40个不同核苷酸序列的拷贝数变化的新方法。MLPA为一种定性和半定量技术，每一个待测基因均包含一长一短的两个荧光标记探针，这对探针能够与染色体靶序列进行分子杂交，经连接酶连接、多重PCR扩增后将产物用序列基因分析仪电泳分析检测结果。MLPA技术具有通量相对高（可同时检测几十个样本）、速度快（24～48 h可得到检测结果）、分辨率高（可识别50～70 bp的拷贝数变异）的特点[4]。该技术自诞生后已在基因拷贝数分析、异倍体检测、产前诊断、突变缺失、单核苷酸多态性等多方面检测研究中广泛应用[25]。早在2009年国外就将MLPA与FISH及染色体核型分析检测结果进行了比对，结果显示MLPA检测灵敏度、特异度可达100%，证实了MLPA用于染色体非整倍体检测的有效性[26]。随着MLPA技术的推广运用，研究者逐渐发现MLPA应用于SA组织染色体异常的检测具有一定的临床应用价值，但也存在一定的局限性，如无法检测多倍体、平衡易位以及无法对探针不涉及的未知染色体变异进行检测等。MLPA技术存在自身的优势与劣势，应从实验室自身具体情况出发，选择合适的检测分析方法，以期为患者提供更全面的遗传咨询信息。

2.5 染色体微芯片技术

CMA技术是近年来发展起来的高通量检测技术，主要包括两大类：微阵列比较基因组杂交技术（array comparative genomic hybridization，array-CGH）和单核苷酸多态性微阵列技术（single nucleotide polymorphism array，SNP-array）。

比较基因组杂交技术（comparative genomic hybridization，CGH）是自1992年后发展起来的一种分子细胞遗传学技术，其基本原理将待测DNA和对照DNA分别标记不同的荧光素后与正常染色体杂交，经荧光数字成像系统扫描后通过比较两种荧光素的相对浓度来检测两种DNA拷贝数的变化。CGH 检测分辨率约为 3～10Mb[27]，与核型分析技术检测分辨率相当，为了提高分辨率，研究者将微阵列技术引入，诞生了array-CGH技术。Array-CGH技术通量高，分辨率可达200 kb，并且能一次性扫描全基因组拷贝数变异（copy number variation，CNV），尤其是对全基因组微小染色体异常的检测更是将染色体病的诊断提高到基因水平。临床已将该技术应用于发育迟缓/智障、自闭症、先天畸形等方面的病因筛查[28]。而 Gao J等[29]的研究则证实了该技术用于流产病因分析的可靠性和适用性，但该研究结果也表明array-CGH技术并不适用于多倍体的检测。同时，基于其检测原理，array-CGH技术对于芯片探针无法覆盖的染色体区段将无法检测，这将限制了发现新发疾病或突变的可能；对于单亲二倍体（uniparental disomy，UPD）的检测也受到限制。Agilent公司的芯片是目前array-CGH技术的主流平台。

与array-CGH技术检测原理不同，SNP-array技术只需将杂交后的待测样本与一整套正常基因组对照资料进行对比即可获得诊断。除了array-CGH技术的检测范围以外，SNP-array技术还能够检出核型分析、MLPA、FISH及array-CGH都无能为力的杂合性缺失（Loss of Heterozygosity，LOH）和UPD[30]。UPD与完全性葡萄胎相关，也是导致流产的原因之一[31]。虽然SNP-array技术具有独一无二的检测能力，但高昂的成本阻碍了该技术在临床上的普及，目前只有有限的临床科室在使用该技术。与array-CGH技术局限相同的是，SNP-array技术也不能检测未知的突变或疾病。此外，SNP-array技术对于染色体的平衡易位、倒位、多倍体（除三倍体外）等也无法检测。Affymetrix公司的芯片是目前SNP-array技术的主流平台。

CMA技术具备其他检测技术所不能达到的检测能力，且对样本要求低，对于流产物样本常为陈旧标本尤为适宜。但其高分辨率也是一把“双刃剑”，虽然能为流产病因分析提供全面的信息，但检测出的小片段CNV常常也给临床报告解读医生带来困扰，尤其是对于现有数据库中尚未明确的CNV的解读需要更加谨慎。

2.6 下一代测序技术

自2005年以来，NGS从生物医学研究领域逐渐应用到临床诊断，将临床分子诊断推进一个新高潮。NGS技术的基本原理是基于PCR扩增，将带有标志物的碱基加入反应中，根据碱基互补原则，碱基结合DNA模板时采集生物标志物发出的信号进行序列信息的读取，以达到测序的目的。根据采集信号的不同，目前临床上常用的NGS平台分别有以采集光信号为代表的Illumina公司的Solexa测序平台及以采集H+流信号为主Life Technologies公司的 Ion torrent半导体测序平台[32]。NGS最早用于临床染色体异常检测为无创产前诊断（noninvasive prenatal testing，NIPT），其检测的准确性及可靠性已得到大规模临床应用数据的支持[33，34]。随着NGS技术的进步和测序成本的大幅下降，NGS在临床各领域的应用如雨后春笋般普及开来。受益于其成本的下降及操作的简便，NGS也在流产物检测中得到应用。Shen等[35]采用436例早期自然流产的样本评估array-CGH技术和NGS技术流产物检测的应用效能，结果显示array-CGH和NGS检出率高，能够检测出传统核型分析漏检的对于复发性流产夫妇遗传咨询尤为重要的染色体的微重复和微缺失。郭依琳等[36]的研究结果也证明了NGS技术用于流产物遗传学分析的价值。与前面介绍的几项技术相比，NGS除了具有高分辨率、高敏感性和准确性、自动化程度高、成本低、对样本要求低、能够一次性扫面全基因组等优点以外，还可以发现CMA平台未能覆盖的CNV以及尚未有报道的新发突变，这对于流产的病因分析，尤其是反复性流产夫妇的遗传咨询尤为重要。尽管NGS在流产物检测上有众多的优势，该技术平台也存在自身的局限，如NGS不能检出UPD及多倍体异常，而且NGS分辨较CMA平台更高，因此，在临床应用时应该了解技术平台的局限性，为患者的遗传咨询提供准确信息。

3 小结与展望

染色体异常为SA的主要病因。目前临床上用于染色体异常检测的分子生物学技术已经大幅度提高染色体异常检出率，但各具局限性。已有研究将NGS和QF-PCR技术进行联合检测，有效地检出了染色体多倍体。这提示我们在日常临床工作中，应了解各项检测技术的优缺点，通过联合检测手段，在现有技术基础上增加染色体异常检出率，为后续遗传咨询提供更多更准确的信息。