福建省枳椇种质资源遗传多样性的ISSR分析

黄 雯，李阿池，胡应平，杨志坚，明艳林，陈 辉

(1.福建省亚热带植物研究所/福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006；2.漳州市速生丰产林基地管理中心，福建 漳州 363000；3.福建农林大学林学院，福建 福州 350002)

枳椇Hovenia acerba，别名拐枣、鸡爪梨，鼠李科Rhamnaceae枳椇属植物，落叶大乔木，分布于我国华北南部至长江以南地区，南亚国家也有分布，一般生于海拔2100 m以下山区疏林中、林缘、开旷地，集果、药、材、观赏于一身，生长快，适应性强，极具开发价值。枳椇在福建省内多数地区均有分布，主要分布在闽西北山区，但近年来因森林破坏导致枳椇资源量锐减[1]。福建省背靠武夷山脉，受亚热带海洋性季风气候影响，四季分明，温暖湿润，光照充沛，所产枳椇果大、汁多、味甜而无苦涩味，在品质、产量等方面都优于长江以南其他省区。野生枳椇在福建境内分布较广，资源量大，具有规模栽培和产业化开发前景[2]。

目前，国内外对枳椇的研究多集中在果实活性成分提取、药理与栽培等方面[3—8]，在种质资源遗传多样性与DNA分子鉴别方面仅见RAPD分析[9—10]。ISSR标记技术结合了SSR标记和RAPD标记的优点，克服了RAPD标记的缺点[11]，具有样品用量少、操作简单、可靠性与重复性好、多态性高等优点，已被广泛应用于植物遗传多样性研究[12—17]。本文建立和优化了枳椇ISSR分子标记体系，对福建省12个种源地35个枳椇单株进行遗传多样性分析，探讨其亲缘关系，旨在更好地了解福建省枳椇种质资源情况，为枳椇良种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来源于福建省12个种源地的35株枳椇，地理位置见表1。植物基因组DNA提取试剂盒购于杭州博日科技有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，ExTaqDNA聚合酶与dNTP购于大连宝生物技术有限公司。

表1 供试枳椇种源地概况Table 1 The overview of Hovenia acerba sources

1.2 方法

1.2.1 枳椇基因组DNA制备 使用Biospin植物基因组DNA提取试剂盒提取枳椇嫩叶基因组DNA。提取的DNA经紫外可见分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测合格后，-20 ℃保存备用。

1.2.2 枳椇ISSR反应体系建立与优化 参考刘兴菊等[18]的鼠李科枣属ISSR体系，设立ISSR-PCR基本反应体系：总体积 25 μL，10×ExTaqBuffer(Mg2+plus) 2.5 μL，dNTP Mixture 375 μmol·L-1，引物0.2 μmol·L-1，DNA 模板 50 ng，ExTaq酶 1.5 U，ddH2O 15.95 μL。对引物(0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1)、dNTP Mixture (125、250、375、500 μmol·L-1)、模板 DNA (25、50、75、100 ng)、Taq酶(0.5、1.0、1.5、2.0 U)做优化筛选。分别设置某一成分梯度变化，其他成分采用基本反应体系，比较扩增效果。

1.2.3 DNA扩增与 PCR产物检测 采用优化的 ISSR反应体系，在温度梯度热循环 PCR仪(德国EPPENDORF Master-cycler05331)中扩增。将扩增产物与1/6体积的6×Loading Buffer混匀，上样7.5 μL于含0.5 μg·mL-1EB的1% TAE琼脂糖凝胶上，1×TAE电泳缓冲液，电压110 V电泳1.5 h，用标准λDNA(2000 Marker，博日科技)作对照，凝胶成像系统紫外光下观察并成像。

1.2.4 引物筛选 以提取的多个DNA样品为模板，对50条ISSR引物进行筛选，最终筛选出10条扩增条带清晰、稳定性好、多态性较高的引物(表2)。

表2 筛选出的ISSR引物序列Table 2 The sequences of ISSR primers

1.2.5 扩增与数据统计 利用筛选的 10条引物对35个供试材料进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到指纹图谱。人工检测条带的有无，当某一位点扩增带出现时，赋值为“1”，不存在时赋值为“0”，从而把图形数据转换成二元数据。假定种群在这些分子标记位点处于哈迪-温伯格平衡状态，利用POPGENE32软件计算遗传参数：观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon多样性指数(I)、Nei’s遗传距离和遗传相似性，并根据遗传相似性，采用NTsys 2.10e软件进行UPGMA聚类分析，构建亲缘关系树。

2 结果与分析

2.1 ISSR反应体系的优化

2.1.1 引物浓度 引物浓度会影响特异性，浓度过高会导致非特异性产物扩增，太低则扩增产物太少。从图1: a可以看出，当引物浓度为0.1 μmol·L-1时无条带；当引物浓度为0.2 μmol·L-1时扩增的条带较模糊；当引物浓度为0.4 μmol·L-1时条带最明亮、清晰。因此，引物最佳浓度为0.4 μmol·L-1。

2.1.2 dNTP浓度 dNTP是PCR扩增产物的原料。在PCR反应中，dNTP浓度过高会导致错误掺入，过低则影响扩增产量和合成效率，甚至会因dNTP过早消耗而使产物单链化，影响扩增效果。不同反应体系，dNTP最佳浓度不尽相同。从图1: b可以看出，dNTP浓度为125 μmol·L-1时，扩增出的条带十分模糊；dNTP浓度为500 μmol·L-1时完全没有扩增出条带；dNTP浓度为375 μmol·L-1时，扩增的条带最明亮、清晰，故此浓度为最佳浓度。

2.1.3 模板DNA含量 从图1: c可以看出，模板DNA用量为25 ng时，扩增出的条带十分模糊；模板用量为75 ng和100 ng时扩增的带条明亮、清晰。PCR扩增时，模板DNA含量过低会导致无扩增条带；但含量过高时，由于提取的DNA纯度无法达到100%，其过高含量的抑制物质会对PCR反应产生抑制。因此，选择75 ng为最佳模板DNA用量，即浓度为3 ng·μL-1。

图1 引物、dNTP浓度以及DNA模板、Taq酶含量对枳椇ISSR-PCR的影响Fig.1 Effect of the content of primer, dNTP, template DNA and Taq polymerase on ISSR-PCR from Hovenia acerba

2.1.4Taq酶含量Taq酶含量的选择与模板DNA含量、扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，还可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量。但酶量过少时反应性能会下降。从图1: d可以看出，当Taq酶含量为0.5 U时条带较淡；当Taq酶含量为1 U时扩增效果最好；当Taq酶含量为2 U时，出现非特异性扩增，带型出现弥散现象。因此，选择1 U为最优酶含量进行后续实验。

优化后的枳椇ISSR-PCR扩增体系：反应总体积25 μL，10×ExTaqBuffer (Mg2+plus) 2.5 μL，dNTP Mixture 375 μmol·L-1，引物 0.4 μmol·L-1，DNA 模板 75 ng，ExTaq酶 1 U，ddH2O 14.55 μL。程序：预变性 94 ℃ 5 min；变性 94 ℃ 30 s，退火 50 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 90 s，35 个循环；最后延伸 72 ℃ 7 min。

2.2 ISSR扩增结果与多态性

采用优化的ISSR反应体系及筛选出的10条引物对35个样品进行PCR扩增。共扩增出基因组DNA中175个位点，分子量范围100～2000 bp。其中，多态性位点155个，占扩增总位点数的88.57%。每条引物扩增的位点数 15～23个，平均扩增位点数17.5(表3)。扩增位点数最多的为引物ISSR14，达23个；最少的为引物ISSR4、ISSR22、ISSR33，各有15个位点。多态性最好的是引物ISSR13，扩增出20个位点，多态性100.00%(图2：A)。扩增的175个位点中，有20个为各基因型所共有，为35个材料间的同源性提供了依据。此外，不同引物扩增的位点数不同，同一引物不同基因型扩增的位点数也不一样，充分体现了枳椇基因组 DNA的多态性，说明供试材料之间的遗传差异性；10条引物在不同样品间产生各自的特征带谱，具有较好的重复性。引物 ISSR13、ISSR45对35个样品扩增结果见图2。

表3 ISSR各引物对35份枳椇材料的扩增位点数Table 3 Locus amplified by ISSR primers from 35 Hovenia acerba germplasms

图2 引物ISSR13 (A)和ISSR45 (B)对35份枳椇材料的ISSR扩增图谱Fig.2 Map of bands amplified by ISSR13 and ISSR45 from 35 Hovenia acerba germplasms

2.3 基于ISSR标记的枳椇种质资源遗传关系分析

为了确定各供试材料之间的遗传关系，通过 ISSR标记，假定处于哈迪-温伯格平衡下，计算 35份枳椇材料的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon多样性指数(I)、Nei’s(1972)遗传距离与遗传相似性。从表4可以看出，枳椇35份材料群体的Na为1.8857，Ne为1.4300，H为0.2572，I为0.3959，说明福建省12个种源地的枳椇种质资源遗传多样性丰富，具较大开发利用价值。

根据遗传相似性进行UPGMA聚类分析，构建各材料的亲缘关系树状图，以遗传相似系数0.74为阈值，35份材料被分成A、B、C、D四大组(图3)。A组包含永定、建瓯、清流、永春、连城、大田等6个地区的16份资源，其中永定、建瓯、清流、永春的所有样品聚在该组，说明四地的枳椇亲缘关系较近，而来自大田的样品26和连城的样品3比较特殊，并未与其相同地区的其他样品聚在一起。B组包含地理位置相邻的松溪和浦城的全部样品，说明两地枳椇亲缘关系较近。C组包含了政和、大田、沙县、顺昌、福州、连城的13份资源。D组包含连城的样品4与政和的样品13。连城的3份样品分别位于 A、C、D三组，说明连城的枳椇种质资源遗传多样性最丰富。

表4 供试枳椇材料遗传多样性参数Table 4 Summary of genic variation statistics for all loci of Hovenia acerba germplasms

图3 35份枳椇材料ISSR标记聚类分析Fig.3 Dendrogram of 35 accessions of Hovenia acerba generated by ISSR data using the UPGMA method

3 讨论

3.1 ISSR体系建立的问题

ISSR优化体系的建立，许多物种均有研究，但是不同物种间存在一定的差异。对于未见ISSR研究的物种可参考其近缘种的ISSR反应体系进行优化。本研究参考了同为鼠李科的枣属ISSR反应体系建立枳椇ISSR反应体系[18]，且得到较好的效果。

PCR反应涉及诸多因子，各因子均对PCR结果的稳定性有较大影响，确定合适的反应参数是PCR特异扩增的前提。影响PCR反应的主要因子包括模板DNA浓度与纯度，引物、dNTP、Taq酶以及Mg2+浓度等。模板DNA浓度对PCR反应的影响，不同研究者得到的结果差异较大。本研究显示，用于枳椇ISSR实验的模板DNA最佳浓度为3 ng·μL-1，而ISSR-PCR反应对DNA纯度要求不高。

获得丰富的条带是分子标记实验中至关重要的环节。传统的分子标记实验中DNA聚合酶多用rTaq酶。本研究发现，改用ExTaq酶得到的条带数是rTaq的两倍，这可能与ExTaq的高保真性有关，且使用ExTaq后PCR的稳定性与可重复性也比rTaq强。

3.2 福建省枳椇种质资源亲缘关系分析

利用筛选出的10条引物对35份枳椇种质资源进行ISSR-PCR扩增，共扩增出基因组DNA中175个位点，其中多态性位点有155个，占扩增总位点数的88.57%，说明35份枳椇种质资源具有较高的遗传多样性。对35份枳椇种质资源进行聚类分析，以遗传相似系数0.74为阈值，可分成四大组。从聚类结果看，来自福建省12个种源地的35份枳椇种质资源的亲缘关系既与生态环境、地理来源等地域分布有关，也与人类活动的干预密不可分。

首先，生态环境相同、地理来源一致的枳椇种质资源遗传关系较近，能聚成一组，具有明显的地域分布规律。如闽北相邻的松溪、浦城所有样品聚在一起，组成了B组；各县的大多数枳椇资源较为明显地在较近的遗传距离上聚在一起，如永定的样品1和2，大田的样品6、7、8，沙县的样品9、10、11，政和的样品14、15、16、17，建瓯的样品28、29、30、31、32、33、34、35等。

其次，鸟类、兽类、人类的活动对福建省枳椇种质资源的亲缘关系影响较大。来自大田的样品26与大田其他3株枳椇遗传距离相去甚远，却与清流、永定、建瓯、永春的样品聚在一组，其中样品26与清流的样品25遗传相似系数高达0.84。据调查，大田样品26植株胸径十分粗壮，达88 cm，树龄也比其他枳椇高，应在60年以上，每年产生大量的种子散落地表。永春、永定、大田、清流、建瓯五地分属福建省南部、中部和北部，其枳椇种质资源在分子水平上反映出的较近的亲缘关系与它们所处的地理位置形成鲜明的反差。位于北部的建瓯和位于东南部的永春、西南部的永定等地相隔三四百公里，且福建是多山地区，各地之间有许多山峦相隔，清流、永定采集的枳椇种质资源均为野生型，可排除人为引种的可能，推测可能来源于鸟类或兽类迁徒活动传播的枳椇种子。而建瓯枳椇种植于庭院，应是人为引种自其他地区。福州的样品12与沙县3份材料聚在一起，有较为接近的亲缘关系，由于沙县的3株枳椇皆为人工种植的庭院树种，而福州的枳椇极有可能是野生的，故沙县3份材料有人为引种自福州的可能。来自政和的样品13与连城的样品4聚为一组，与其他枳椇种质资源的亲缘关系都较远。采样时调查得知，样品13与4皆为人工种植，可能由其他较远地区引种而来。综上，鸟类、兽类的活动，以及人类的引种驯化活动促进了福建省枳椇种质资源的遗传多样性。

3.3 福建省枳椇种质资源遗传多样性及其保护

研究表明，35份福建省枳椇种质资源的最大遗传距离为0.6004，最大相似性为0.9486，遗传多样性较为丰富，这与福建省的丘陵多山地貌、背靠武夷山脉的自然地理环境以及受亚热带海洋性季风气候的影响、四季分明、阳光充沛、温暖湿润的气候条件息息相关。人为因素对福建省枳椇种质资源的影响较大，引种驯化丰富了福建省枳椇种质资源的遗传多样性，然而近年来，因森林的破坏或人为的各种因素对枳椇进行砍伐，造成其资源量锐减。一个物种或居群的遗传多样性程度越高、变异越丰富、资源蕴藏量越大，对环境的适应能力就越强。因此，对福建省枳椇种质资源的保护刻不容缓。

ISSR分子标记能较好地反映枳椇种质资源的遗传差异，揭示其遗传多样性。供试的福建省12个种源地35份枳椇材料存在着丰富的遗传多样性。研究结果对福建省枳椇种质资源的开发利用、良种选优、杂交育种、资源保护等提供了分子水平的理论依据。