咸干蓝点马鲛品质特征与优势菌群分析*

王睿迪 刘胜男 王 玉 赵延宁 薛 勇

(中国海洋大学食品科学与工程学院 食品科学与人类健康实验室 青岛 266003)

蓝点马鲛(Scomberomorus niphonius)，俗称鲅鱼，具有鱼刺少、味道鲜美、营养丰富等特点，是北方沿海地区常见的食用鱼类。咸干鲅鱼是以鲜(冻)鲅鱼肉为主要原料，采用食盐腌制和干燥工艺加工而成的典型咸干鱼制品，也是我国沿海地区最具代表性的传统水产制品。咸干鲅鱼具有风味独特、易于贮藏的特点，但目前加工方式仍以手工作坊式加工和自然晾晒为主，产品存在含盐量高、风味不稳定等问题。目前我国对传统咸干鱼制品的研究还缺乏系统性，尤其是针对咸干鲅鱼的研究还非常少。

为了了解市售咸干鲅鱼产品的品质情况，本研究采集了7种不同产地的咸干鲅鱼产品，通过感官评价筛选出青岛产一卤鲜咸干鲅鱼作为代表性研究对象，对品质相关的理化指标进行了检测分析。另外，由于优势菌对干腌水产品发酵过程及风味的形成具有重要的作用(吴海燕等，2010)，本研究还对咸干鲅鱼中的优势菌进行了分离纯化和种类鉴定，并对菌株的基本生理生化性质进行了研究，以期为咸干鲅鱼的现代化加工和质量控制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从烟台、威海、青岛、日照、连云港、温州、 大连7个地区分别采集咸干鲅鱼样品，分别编号为1～7。样品体长为25～30 cm，质量为250～300 g。

Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)；组胺测定试剂盒(Kikkoman公司，日本)；革兰氏染色试剂盒(日水制药公司，日本)。

MRS培养基、MRS肉汤、RBA培养基、PCA培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)；AgNO3、K2CrO4、三氯乙酸、MgO、硫代巴比妥酸、三氯甲烷、FeCl2、K4Fe(CN)6·3H2O、乙酸锌、对氨基苯磺酸、溴甲酚紫均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；甲醇为色谱纯(天津博迪化工股份有限公司)。

1.2 主要仪器

Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪(FOSS有限公司，瑞士)；7200型可见分光光度计(UNIC公司， 德国)；IKA-TI8型高速分散机(IKA有限公司，德国)；台式高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)；Fluo ViewTMFV1000型激光共聚焦显微镜(Olympus公司，日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 感官评价 将7份样品分别清洗干净并浸泡脱盐后，在蒸锅上蒸15 min。由15名经过培训的感官评价人员按照表1综合组织状态、色泽、气味、滋味、咀嚼度5个方面进行评分。

1.3.2 理化指标测定方法 参照GB 5009.44-2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》(2016)，采用银量法测定NaCl含量；参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》(2016)，采用直接干燥法测定水分含量；参照GB 5009.33-2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》(2016)，采用分光光度法测定NaNO2含量；参照GB 5009.228- 2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》(2016)，采用自动凯氏定氮仪法测定TVB-N含量。

表1 咸干鱼感官评分标准 Tab.1 Sensory evaluation standard for dried salted S.niphonius

TBARS值的测定参照刘昌华(2012)的方法，并略作修改。取5 g鱼肉切碎，加10% TCA 溶液45 ml，匀浆后静置1 h，2000 r/min离心10 min，过滤，用H2O2定容至50 ml。取2 ml滤液加0.02 mol/L的TBA溶液2 ml，在沸水浴中反应20 min，冷却后用分光光度计测定532 nm处的吸光值。

1.3.3 微生物计数与分离纯化 参照贺林娟(2013)的方法，并略作修改。无菌条件下取咸干鱼样品25 g，剪碎后加入装有225 ml无菌生理盐水和玻璃珠的锥形瓶中，振摇充分得到样品原液。用无菌生理盐水将样品原液按1：10的比例进行梯度稀释。采用平板涂布法，将各稀释液分别接种于PCA、MRS和RBA固体培养基中，分别按照 GB 4789.2-2016(2016)、 GB 4789.35- 2016(2016)、GB 4789.15-2016(2016)进行菌落总数、乳酸菌菌落数、霉菌及酵母菌菌落数测定。

从PCA、MRS和RBA平板上挑取优势菌落于相应分离培养基上划线分离，30℃培养48 h，重复 2～3次获得纯的单菌落。

1.3.4 生理生化实验 参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等,2001)、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》(凌代文等,1999)以及相关文献(卢晓莉,2007; 朱雯娟,2015)对纯化的菌株进行革兰氏染色、过氧化氢酶、葡萄糖产酸产气、耐盐性等生理生化实验。

1.3.5 优势菌株的种类鉴定 将纯化后的菌株接种于相应的种子培养基，30℃条件下200 r/min振荡培养24 h，离心收集菌体，采用DNA抽提试剂盒提取DNA。将提取出的DNA样品交由生工生物工程上海股份有限公司进行后续的PCR扩增及16S rDNA测序。

测序结果在NCBI数据库中进行BLAST同源性检索和比对分析，从GenBank中调取与其同源性较高的相似序列，使用MEGA 7.0进行序列比对，比对结果用邻接法(Neighbor-joining method)构建系统发育树，通过自举分析检测置信度(1000次重复)(姚学良等，2015)。

2 结果与分析

2.1 咸干鲅鱼感官评价结果

不同产地咸干鲅鱼产品的感官评价结果如图1所示。从气味方面来看，1、3号样品清香纯正，有咸干鱼特有风味，2、4号气味稍淡，7号氧化味重。在口感方面，3号样品咸淡适中，评分最高，其他样品均偏咸，得分较低，且差别不大。另外，3号样品组织状态、咀嚼度两项指标对应的评分也较高。因此，选择3号样品即青岛产咸干鲅鱼作为后续研究的实验对象。

图1 不同产地咸干鲅鱼感官评价结果 Fig.1 Sensory scores of seven dried salted S.niphonius

2.2 咸干鲅鱼理化指标检测结果

青岛一卤鲜咸干鲅鱼理化指标的测定结果如表2所示。样品水分含量为54.4%，属于半干水产品。GB/T 30894-2014《咸鱼》(2014)中规定NaCl含量应在3%～11%的范围内，检测样品的NaCl含量为3.10%，属于低盐咸鱼。NaNO2含量为5.07 mg/kg，大幅低于GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(2014)中所规定的腌腊肉制品中NaNO2(以NaNO2或KNO2计)≤30 mg/kg的限量要求，因此传统咸干鲅鱼NaNO2超标的风险相对较小。TVB-N是指动物性食品由于酶和微生物的作用使蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，常用来表征样品的新鲜度。样品中TVB-N含量高达40.12 mg/100 g，而GB 2733-2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》(2015)中规定鲜、冻海水鱼中的TVB-N含量不应超过30 mg/100 g，这说明咸干鲅鱼产品相较于鲜、冻鲅鱼原料蛋白质降解程度较大，而这可能与发酵过程有关。脂肪氧化酸败是冻藏过程中水产品发生品质劣变的主要原因之一，利用硫代巴比妥酸与丙二醛反应生成粉红色物质测定TBARS值，可以准确反映脂质氧化程度(曹荣等,2016)。Ersoy等(2008)认为鲜、冻水产品的TBARS值≤8.0 mg/kg时适宜人类食用，咸干鲅鱼的TBARS值为10.0 mg/kg，略高于8.0 mg/kg的推荐标准，这与样品水分含量低有关，且尚未对产品的感官品质造成明显影响。

表2 咸干鲅鱼的基本理化指标 Tab.2 The basic physicochemical properties of dried salted S.niphonius

2.3 咸干鲅鱼菌落计数结果

由各计数平板得知咸干鱼样品中菌落总数为1.68×105CFU/g，乳酸菌菌落数为1.06×105CFU/g，霉菌及酵母菌落数为4.7×104CFU/g。腌干鱼样品中的微生物以细菌菌相为主，霉菌及酵母菌相对较少。咸干鲅鱼的腌渍和干燥工艺使得产品渗透压升高而水分活度降低，从而抑制了部分微生物的生长。另外，咸干鲅鱼产品多采用低温保藏，微生物生长也受到了一定的影响。

2.4 典型菌株的生理生化特性

咸干鲅鱼的品质形成过程主要是微生物发酵的结果。从计数平板上筛选到10株典型菌落，分别编号为X1～X10，其生理生化特征如表3所示。1955年芬兰科学家Niinivaara提出理想的发酵菌株应具有革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阳性、快速产酸、不产气、耐盐性、不产生物胺以及能抑制大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等生理特征(Ijonget al,1996; 刘成江等,2009; 李凤彩等,2002)。在所筛选到的10株菌中，X2、X4、X5、X9为革兰氏阴性菌，其余6株为革兰氏阳性菌，该6株细菌均具有抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性(表4)，其中仅X1符合上述发酵微生物的标准。因此，综合判断菌株X1可能是咸干鲅鱼发酵过程中的主导菌株。

表3 典型菌株的生理生化特征 Tab.3 The physiological and biochemical properties of dominant bacteria strains

表4 典型革兰氏阳性菌菌株的抑菌活性 Tab.4 The antibacterial activities of typical Gram-positive bacteria strains

2.5 优势菌株的种类鉴定结果

菌株X1、X2、X3、X4分别占菌落总数的21%、14%、11%、10%，在数量上占有优势。将菌株X1～X4的16S rDNA序列分别与GenBank中的已知序列进行比对，并利用MEGA 7.0进行系统发育树的构建，结果见图2。

根据同源性分析，菌株X1与Lactobacillus sakeistrain YY1(KM267631.1)的遗传距离最近，二者的同源性为100%，因此可以确定X1为乳酸杆菌属(Lactobacillus)的清酒乳杆菌；菌株X2与X4为同一类群，属于肠杆菌属(Enterobacter)中的两个种，X2和X4分别与产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、香坊肠杆菌(Enterobacter xiangfangensis)的亲缘关系最为密切；菌株X3属于短小芽孢杆菌属(Lysinibacillus) 并与长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macrolides)的亲缘关系最近。

由此，咸干鲅鱼中的优势菌株主要集中在乳杆菌科(Lactobacillaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)以及芽孢杆菌科(Bacillaceae)。Huss等(1990)提出当水分活度为0.98～0.93、盐度为3.5～10时，食品及其原料中的优势微生物为乳酸杆菌科、肠杆菌科、芽孢杆菌科、小球菌科(Micrococcaceae)以及霉菌。而近年来国内外学者先后对鱼酢、腊鱼等鱼制品进行菌相分析，结果均表明乳酸菌、微球菌、葡萄球菌为发酵优势菌群，影响着鱼制品的风味，并将筛选菌种成功应用于鱼制品，缩短生产周期(杨锡洪等,2009; Anihouviet al,2007)。曾令彬等(2007)的研究表明，腊鱼制品腌制过程中微生物菌群与风味物质的形成密切相关，腌腊鱼制品的优势菌为乳酸菌。Paludan-Müller等(2002)也提出乳酸菌是肉制品发酵过程中的优势微生物，并能促进发酵鱼肉类制品的风味形成。Rantsiou等(2005)从自然发酵香肠中分离到358株乳酸菌，其中以弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和清酒乳杆菌为主。Bonomo等(2008)从意大利南部的传统发酵香肠中分离乳酸菌,其中清酒乳杆菌是优势菌(67%)，其次是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(16%)。本研究结果与上述研究结论基本一致。

3 结论

咸干鲅鱼属于半干低盐咸干鱼制品，NaNO2含量在食品安全标准规定的范围内，样品的TVB-N含量偏高，这可能与原料新鲜度以及发酵过程中蛋白质降解有关，TBARS值为10.00 mg/kg，脂质氧化程度在感官可接受的范围内。咸干鱼样品中的微生物以细菌为主，清酒乳杆菌、产气肠杆菌、长赖氨酸芽孢杆菌和香坊肠杆菌比例相对较高。结合生理生化特征，清酒乳杆菌可能是传统咸干鲅鱼发酵过程中的优势菌株。

图2 基于16S rDNA的优势菌株X1～X4基因序列的系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree of strain X1～X4 on the basis of 16S rDNA sequence