MicroRNA异常表达谱与前列腺癌的关系

李 琦 综述，徐 佳，温 雪，尚晓泓 审校

(中国中医科学院西苑医院检验科，北京 100091)

前列腺癌是最常见的癌症，也是美国男性癌症中导致死亡的第二大原因。在中国，随着寿命的延长、环境的改变和诊断技术的改进，前列腺癌的发病率逐渐升高，目前，前列腺癌已成为国内泌尿生殖系统的首要癌症[1]。传统上对前列腺癌的研究集中于影响蛋白质组的基因组和表观遗传学的改变，但在过去10年中，越来越多的研究证明前列腺癌的发生依赖于大量非编码RNA的改变[2]。

微小RNA(miRNAs)是一类较小的(20～25个核苷酸)进化保守的非编码RNA，通过序列依赖的识别机制对转录水平进行调控[3]。miRNAs在细胞生物学过程的调控中发挥着关键作用[4]，参与了包括前列腺癌在内的各种人类恶性肿瘤的发生和进展[5]。miRNAs作为前列腺癌生物标志物的潜在效用引起了人们越来越多的关注，本文主要介绍近几年发现的对前列腺癌发生和发展有贡献的miRNAs及其靶点，包括其在细胞增殖、转移和侵袭、细胞周期和凋亡、上皮-间质转化(EMT)、前列腺癌肿瘤干细胞(PCSC)等中的作用及机制。

1 影响前列腺癌细胞的增殖、转移和侵袭

近几年，miRNA在肿瘤中的生物学意义作用方面引起了人们的广泛关注，目前已有大量实验证明，miRNAs对前列腺肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制或促进作用。

CHI等[6]收集了20位前列腺癌患者的肿瘤组织和肿瘤邻近组织，对肿瘤蛋白D52(TPD52L2)和microRNA-503(miR-503)分子之间的相互作用进行预测，并分别用阴性对照、miR-503模拟物、miR-503抑制剂转染DU145细胞，采用RT-RNA和Western blot法检测miR-503和TPD52L2 mRNA的水平及TPD52L2蛋白的表达水平，用Transwell和MTT分析前列腺细胞的迁移和增殖能力，以此来探讨miR-503在前列腺癌细胞中的表达及其对前列腺癌的作用和作用机制。结果发现前列腺癌组织中TPD52L2表达增加而miR-503表达降低；TargetScan将TPD52L2的3′非翻译区(3′UTR)鉴定为miR-503的直接靶标；与空白组和阴性对照组相比，转染miR-503模拟物的DU145细胞中miR-503的表达显著增加，TPD52L2 mRNA和蛋白水平显著降低，迁移细胞数量显著减少，吸光度显著降低，这些结果表明miR-503的过表达抑制了TPD52L2的转录翻译和DU145细胞的迁移和增殖能力。

GUAN等[7]发现去势抵抗性前列腺癌(CRPC)组织比雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)组织miR-744的表达水平更高，且CRPC细胞(DU145和PC3细胞株)和雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)细胞(LNCaP-AI)中miR-744表达水平显著高于ADPC细胞(LNCaP)，并且miR-744的表达水平与CRPC患者的生存呈负相关。该研究将抗miR-744寡核苷酸或抗NC寡核苷酸、miR-NC、miR-744模拟物转染到PC3、Du145和LNCaP-AI细胞中，通过分析发现与抗NC寡核苷酸相比，抗miR-744寡核苷酸明显抑制PC3，DU145和LNCaP-AI细胞的增殖、迁移和侵袭；相应地，与miR-NC转染相比，miR-744模拟物的过表达显著增强了LNCaP细胞的增殖、迁移和侵袭。通过基因表达阵列，途径富集分析和Western blot，进一步发现miR-744通过靶向作用于Wnt/β-catenin信号传导的多个负调节物(包括SFRP1、GSK3β、TLE3和NKD1)显著激活Wnt/β-catenin途径。在分子水平上，发现 NKD1是miR-744的主要功能靶标。因此，该研究表明miR-744可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

ZHANG等[8]比较了LNCaP、DU145、PC-3和RWPE-1细胞系中miR-30c的表达水平并研究了miR-30c的过表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及用Western blot分析了miR-30c对KRAS的影响。结果显示与LNCaP、DU145和RWPE-1细胞系相比，PC-3细胞系中miR-30c的表达显著降低。 miR-30c在PC-3中的过度表达抑制了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，与阴性对照组相比，miR-30c过表达细胞系中KRAS蛋白表达水平明显下调，表明miR-30c的过表达可能导致KRAS蛋白水平下调，从而抑制前列腺癌细胞系增殖、迁移和侵袭。

2 干扰前列腺癌细胞周期和细胞凋亡

细胞增殖的快慢是由完成一个细胞周期的时间长短决定的。整个细胞周期分为G1、S、G2和M4期，而G1期则是整个细胞周期长短的关键。大量实验证明miRNAs主要通过调节G0/G1细胞群和靶向调控相关基因和蛋白质的表达水平影响肿瘤细胞的细胞周期并最终诱导肿瘤细胞凋亡的。

HUANG等[9]对前列腺癌组织中选择性剪接因子/剪接因子2(ASF/SF2)的表达水平和ASF/SF2是否为miR-30c的直接靶基因进行了研究，并用miR-30c模拟物转染前列腺癌细胞系后检测miR-30c对前列腺癌细胞凋亡的影响。结果发现与健康组织比较，前列腺癌组织表现出更高水平的ASF/SF2，并揭示了miR-30c与ASF/SF2基因的3′非编码区靶向结合，从而下调ASF/SF2蛋白的表达。同时该研究还发现ASF/SF2降低引起细胞增殖的减少与细胞周期停滞相关，且miR-30c过表达的细胞中凋亡细胞的百分比显著增加，表明 miR-30c通过下调ASF/SF2诱导前列腺癌细胞周期停滞和细胞凋亡。

COLDEN等[10]分析了miR-466对前列腺癌细胞周期和凋亡的影响。结果发现与对照miRNA相比，miR-466可诱导转移性前列腺癌PC3和DU145细胞中G0/G1细胞周期停滞和细胞凋亡；并进一步证明miR-466通过直接靶向RUNX2并减弱其已知介导前列腺癌骨转移的下游靶基因来部分发挥这些作用。

3 调节前列腺癌的上皮-间质转化(EMT)

EMT是一种多步骤的变化，其中上皮细胞特征丧失并且获得间充质表型。EMT使癌细胞具有转移、侵袭性和干细胞的恶性特性。miRNAs通过调节EMT相关转录因子、上皮和间质基因或关键信号通路来调节EMT[11]。在前列腺癌中，报道了多种调节EMT的miRNAs，如miR-145、miR-200家族、miR-205等[12]。

浆细胞瘤变异易位1(PVT1)是一种新型长链非编码RNA，已被证明在许多肿瘤细胞中上调，并且越来越多的证据表明PVT1可以调控许多癌症相关的细胞过程[13]。CHANG等[14]采用生物信息学分析，Western blot等技术研究了PVT1在前列腺癌中的作用及其机制。该研究表明PVT1通过海绵效应作用于miRNA-186-5p并正向调节Twist1(一种与EMT相关的转录因子)，从而促进EMT，进而促进前列腺癌的转移和侵袭作用。因此，PVT1/miR-186/Twist1调控轴可能是前列腺癌的一种新的治疗靶点。

GURURAJAN等[15]为研究miR-154*和miR-379在前列腺癌EMT中的作用，在间充质型ARCaPM 前列腺癌细胞中引入了shRNA以产生miR-154*敲低(ARCaPM-154*i)或miR-379敲低(ARCaPM-379i)细胞，并使用scrambled shRNA产生对照shRNA载体(ARCaPM-C)。通过qRT-PCR分析发现，与ARCaPM-C相比，在ARCaPM-154*i和ARCaPM-379i细胞中检测到miR-154*和miR-379的表达降低，并且ARCaPM-154*i细胞中STAG2的表达水平显著增加。此外，该实验发现对miR-154 *或miR-379进行抑制后，间充质ARCaPM细胞可逆转为上皮表型，并伴随ARCaPM-154 *和ARCaPM-379i细胞中上皮标志物E-钙黏着蛋白的上调。由此可证明DLK1-DIO3簇的miR-154 *和miR-379通过下调STAG2促进前列腺癌细胞发生EMT。

WANG等[16]为验证miR-802是否可以调节前列腺癌细胞中的EMT，通过分析评估常见的EMT标志物，发现与转染对照miRNA的细胞比较，miR-802模拟物转染的DU145细胞中间质细胞标志物(波形蛋白和N-钙黏蛋白)表达水平降低；上皮细胞标志物(E-钙黏蛋白)表达水平升高。此外，荧光素酶活性分析将Flot2鉴定为miR-802在前列腺癌细胞中的直接靶标， miR-802高表达可降低Flot2的表达水平，从而抑制前列腺癌细胞发生EMT。

4 调节前列腺癌肿瘤干细胞(CSCs)，抑制前列腺肿瘤发生

CSCs是肿瘤块中癌症细胞亚群的一个子集，并被认为是肿瘤发生，抗癌治疗耐药，复发和转移的原因[17]。据报道，miRNA是调控PCSCs干细胞的关键因子。异常表达的miRNA可能导致与CSCs功能相关的特定信号通路失调如TGF-β、Wnt/β-连环蛋白和MAPK途径。因此，鉴定调节CSC特性的特定miRNAs将有助于扩大对前列腺癌分子发病机制的理解，并为前列腺癌治疗设计更好的策略[18]。

CHANG等[18]研究了人类前列腺癌细胞系和非致瘤性前列腺上皮细胞系中miR-7的表达水平，结果发现miR-7在前列腺癌细胞系中显著下调。这暗示了其对前列腺癌潜在的抑制作用。该研究又进一步检测了CD44+CD133+和CD44-CD133-亚群中干细胞因子的表达水平，以此探究CD44+CD133+亚群在前列腺癌中是否具有CSC特征及miR-7发挥作用的具体机制，结果发现CD44+CD133+细胞中干细胞因子的表达水平显著高于CD44-CD133-亚群，miR-7的表达水平显著低于CD44-CD133-亚群，这表明CD44+CD133+具有PCSC特性并且miR-7与PCSC的干性密切相关。此外该研究通过荧光素酶报告基因证明，miR-7通过抑制关键干细胞因子KLF4来消除PCSC的干细胞从而抑制前列腺肿瘤发生，并且miR-7对PCSCs干细胞的抑制作用在异种移植物中可持续数代。

JIN等[19]研究证明，通过寡核苷酸转染的miR-128过表达可抑制体内异种移植瘤的增殖、侵袭和癌细胞克隆，并且其表达水平与前列腺癌细胞的致瘤潜力反向相关。他们进一步筛选了miR-128的潜在靶标并发现miR-128的过表达以细胞类型依赖性方式降低了包括Bmi-1、Nanog、TGFBR1和EGFR在内的前列腺癌细胞中的致癌和干细胞相关基因的表达水平：在PC3细胞中，miR-128显著降低NANOG和TGFBR1水平；而在PPC-1细胞中miR-128降低了E2F3 mRNA水平；在DU145细胞中miR-128减弱了除EGFR外的所有分子的mRNA水平。所有这些基因都与维持肿瘤干细胞特性有关，通过荧光素酶报告基因分析发现，BMI-1为miR-128的直接靶标。这些数据表明，miR-128通过抑制BMI-1的表达而削弱PCSC特性进而抑制前列腺癌的发生。

LIU等[20]检测了miR-1993a-3p对PCSC特性的影响，结果发现与阴性对照相比，用miR-199a-3p转染的纯化的CD44+DU145细胞、PC3和LACP9细胞中均表现出显著降低的克隆效率，表明miR-199a-3p可能在体外抑制PCSC的自我更新，起到负向调节的作用。他们进一步证明了miR-199a-3p过表达减少了CD44+前列腺癌细胞的肿瘤起始能力及来自本体前列腺癌细胞的肿瘤再生,并发现miR-199a-3p可靶向作用于干细胞相关和促有丝分裂分子CD44、c-MYC、细胞周期蛋白D1(CCND1)和EGFR，从而抑制PCSC的扩增和致瘤能力。

5 在前列腺癌化疗药耐药中的机制和作用

紫杉烷类(如多西他赛)已被证明在前列腺癌等肿瘤疾病中是一类具有细胞毒性的化疗药物[21]。虽然紫杉烷能提高晚期前列腺癌的存活率，但其药物耐药性的发展仍不可避免，患者的病情最终会发生进展，因此,只能获得有限的治疗。在前列腺癌中存在多种多西他赛耐药机制：不利的肿瘤微环境、药物外排泵、微观结构和(或)功能的改变以及凋亡缺陷(如Bcl-2的上调或PTEN/PI3K/mTOR途径的激活和MAPK/ERK途径的激活)[22]。

WANG等[23]为研究miR-375在多西紫杉醇耐药中的作用，使用pre-miRNA 慢病毒载体转染miR-375，并考察了外源性过表达miR-375对两种前列腺癌细胞株DU145和PC-3细胞生长的影响。同时，为确定过度表达的miR-375对体内肿瘤生长和化疗耐药的影响，将miR-375过度表达的前列腺癌细胞注入裸鼠皮下。结果发现miR-375在前列腺癌的增殖中发挥了双重作用，虽然miR-375过表达导致细胞生长抑制和细胞凋亡，但miR-375升高也显著降低了细胞对多西他赛治疗的敏感性。为进一步明确耐药机制，该研究用miR-375模拟物转染前列腺癌细胞系，并对SEC23A和YAP1 mRNA的表达进行检测。结果发现SEC23A和YAP1 mRNA表达显著降低。可见miR-375通过调控SEC23A和YAP1表达，影响了对多西他赛化疗耐药性的发展。因此，miR-375或其靶基因SEC23A或YAP1可作为潜在的生物标志物用于在mCRPC阶段化疗和(或)治疗的靶点，以克服化疗耐药性。

SHI等[24]测定了多西他赛耐药PC3细胞中miRNAs的表达并用实时PCR技术对阵列结果进行了验证。结果发现miR-21在PC3R细胞中上调。在PC3野生型细胞中，miR-21的异位表达增强了多西他赛的耐药性，而在PC3R细胞中使用miR-21抑制剂使细胞miR-21沉默后导致细胞对多西他赛敏感。此外，还发现miR-21可以直接下调PDCD4的表达。PDCD4表达的沉默增加了PC3细胞的细胞活力和对多西他赛的抗性，这表明PDCD4是miR-21诱导多西他赛化学抗性的功能靶点。可见miR-21有助于PC3细胞对多西他赛的抵抗，靶向作用于miR-21可减弱前列腺癌对多西他赛的耐药性。

长链非编码RNA CASC2作为miR-183的竞争性内源RNA具有肿瘤抑制作用，而Sprouty2(SPRY2)是RTK信号的关键拮抗剂，也可用作肿瘤抑制剂。GAO等[25]研究发现在前列腺癌组织及细胞系中CASC2和SPRY2的表达水平均有所下调，而CASC2和SPRY2的过度表达可以达到抑制前列腺癌细胞增殖，促进前列腺癌细胞凋亡，增强前列腺癌细胞对多西他赛敏感性的效果，而miRNA-183可降低SPRY2的表达，进而部分减弱多西他赛对前列腺癌细胞的细胞毒性。通过进一步研究发现，CASC2对SPRY2的表达具有正向调控作用，CASC2可直接靶向作用于miR-183，同时结合SPRY2的3′UTR，并通过SPRY2的表达抑制其下游胞外调节蛋白激酶(ERK)信号传导通路的激活。由此可见，CASC2与SPRY2竞争结合miR-183以拯救SPRY2在前列腺癌细胞中的表达，从而通过SPRY2下游ERK信号传导途径增强前列腺癌细胞对多西他赛的敏感性。

6 前列腺癌诊断、治疗和预后的新型标志物

大量研究证明miRNAs在肿瘤诊断、预后和治疗中具有生物标志物的潜在用途，并将其表达水平与临床病理参数联系起来[26]。评估miRNAs在前列腺癌细胞中的表达水平可用于前列腺癌的诊断、预后和进展监测，并且可以通过各种广泛使用的标准技术(如qRT-PCR、微阵列和小RNA测序)轻松检测和准确定量，同时它们可存在于体液中[27]，不需要侵入式活检，因此，可成为前列腺癌治疗选择和判断预后的良好标志物[28]。WASEEM等[29]使用miRNA微阵列芯片，对来自良性前列腺增生症(BPH)和不同病理级别的前列腺癌组织样品进行了全面的miRNA分析。该研究发现与BPH和健康对照组相比，miR-711在前列腺癌组织中显著下调，这与微阵列和qRT-PCR的分析结果一致。他们还发现miR-711的表达与肿瘤细胞的转移和前列腺癌的进展呈负相关，这暗示该新型miR-711在前列腺癌进展中具有肿瘤抑制作用，此外，ROC曲线分析显示miR-711是特异度和灵敏度均较高的候选生物标志物。

WANG等[30]通过 miRNA微阵列分析比较了CRPC和ADPC差异表达的miRNA，结果发现miR-4638-5p在CRPC中表达水平显著下调并且miR-4638-5p在早期阶段比在晚期疾病中的表达高出近4.7倍。在与CRPC发育密切相关的前列腺癌干细胞的单独miRNA微阵列分析中，与未选择的DU145细胞群相比，miR-4638-5p是最显著下调的miRNA，具有近12.6倍的差异。另外，他们还测定了LNCaP、PC3、DU145和LNCaP C4-2B 前列腺癌细胞系中miR-4638-5p的表达水平，结果与在临床样品中的观察结果一致。因此，miR-4638-5p可能会成为前列腺癌诊断和治疗的新型生物标志物。

7 结 论

前列腺癌作为男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其检测目前主要基于血清前列腺特异性抗原生物标志物和数字直肠检查等手段[31]。然而，这些方法可能会造成对患者过度诊断和治疗的不良后果，因此，仍然需要可用于前列腺癌检测和预后的新型生物标志物。近几年，有关miRNA与前列腺癌关系的报道越来越多， miRNA几乎参与前列腺癌所有关键的细胞过程[31]，如本文介绍的miR-503、miR-30c可抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而miR-744对前列腺癌细胞的增殖、转移和侵袭起促进作用；miR-30c、miR-466可诱导前列腺癌细胞的细胞周期停滞和细胞凋亡；miR-186-5p、miR-154 *、miR-379可促进前列腺癌细胞发生上皮-间质转化，而miR-802抑制前列腺癌细胞EMT的发生；miR-7、miR-128、miR-1993a-3p对PCSC的扩增和致瘤能力具有抑制作用；miR-375、miR-21可减弱多西他赛的化疗耐药性，而miR-183的表达则会减弱多西他赛的敏感性；miR-711、miR-4638-5p等可成为前列腺癌诊断和治疗的潜在的新型生物标志物。

miRNA与前列腺癌的相关研究尽管取得显著的进步，但仍然面临很大挑战。首先，miRNA通常被包裹在脂质微泡中而免于降解，这使其对RNA酶和物理化学条件有较强的抵抗力，从而可能会造成生物污染[32]。其次，各研究所使用的研究设计及分析平台等应尽可能地减少差异，从而为临床提供对疾病的诊断、治疗及预后一致有用的信息。另外，对于miRNA与前列腺癌的相关研究多停留在研究阶段，要想在临床实践中使用miRNA作为标志物和治疗靶标，还需要更加深入的临床研究。