HPLC法同时测定半夏泻心汤标准煎液中黄芩苷和盐酸小檗碱含量

2019-03-21 02:54张莹莹季巧遇李诒光吴样明
亚太传统医药 2019年2期
关键词:冻干粉泻心汤小檗

张莹莹,季巧遇,*,李诒光,,吴样明,李 青

(1.江西中医药大学 药学院,江西 南昌 330004;2.江中药业股份有限公司,江西 南昌 330096)

半夏泻心汤出自东汉张仲景《伤寒论》,由半夏、黄芩、黄连、干姜、人参、甘草、大枣七味药组成,是用于心下满而不痛之痞证的治疗方,现代临床多用于治疗慢性胃炎、功能性消化不良、溃疡性结肠炎、急性胃肠炎、肠易激综合征、反流性食管炎、糖尿病胃轻瘫、呃逆等疾病,在胃肠道疾病方面有广泛的治疗效果。黄芩,黄连为方中苦降药,均具有清热燥湿、泻火解毒功效,与辛开药半夏干姜配伍使用,对寒热互结、胸腹闷胀、心下痞满等症有治疗效果。有文献[1]对半夏泻心汤胃内滞留片中黄芩苷、盐酸小檗碱分别进行含量测定,但没有对其在同一色谱条件下进行含量测定的报道。本实验参考相关文献[2-5],建立了同时测定标准煎液冻干粉中指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱的含量测定方法,为更好地控制产品质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪(HPLC),包括1260 DAD 检测器;MS-204S型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司);CPA-225D型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司);科昌达超声波(南昌科昌达超声波设备厂);pH计(瑞士Mettler-Toledo 公司)。

1.2 药品与试剂

半夏泻心汤标准煎液冻干粉(自制,批号:20180706、20180708、20180710);盐酸小檗碱对照品(批号:110713-201613,纯度:86.8%)、黄芩苷对照品(批号:110715-201318,纯度:93.3%)均购自中国食品药品检定研究院;乙腈、磷酸等所用试剂均为色谱纯,水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Zorbax Eclipse SB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.2%磷酸(B)(加入三乙胺调pH值=2.5),梯度洗脱(0~5 min,12%A;5~10 min,12%→20%A;10~20 min,20%→27%A;20~25min,27%→31%A;;25~30min,31%→35%A;流速:1.0 mL/min;检测波长:275 nm;柱温:25 ℃;进样量:10 μL。在上述色谱条件下进样测定,理论板数均大于5 000,分离度均大于1.5,各成分基线分离良好。色谱见图1。

图1 黄芩苷、盐酸小檗碱高效液相色谱

2.2 溶液制备

2.2.1 黄芩苷、盐酸小檗碱对照品溶液制备 精密称取对照品黄芩苷9.65 mg,加甲醇溶解,定容至10 mL;盐酸小檗碱10.79 mg,加甲醇溶解,定容至10 mL,摇匀,取1 mL再用甲醇定容至10 mL,得黄芩苷、盐酸小檗碱浓度分别为0.900 3、0.093 66 mg/mL对照品贮备液;再分别精密量取黄芩苷、盐酸小檗碱对照品贮备液适量于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到混合对照品溶液中黄芩苷、盐酸小檗碱的浓度分别为0.108 0 mg/mL、0.011 24 mg/mL。

2.2.2 供试品溶液制备 取冻干粉样品0.1 g,精密称定,置于25 mL容量瓶中,加80%甲醇溶解,超声(功率:250 W,频率:60 kHz)提取40 min,放冷,用80%甲醇定容至刻度,摇匀,过0.45 μm滤膜,取续滤液即得。

2.2.3 阴性对照溶液制备 按半夏泻心汤标准煎液的处方和制备工艺分别制备缺黄芩、缺黄连的阴性对照样品冻干粉,再按照“2.2.2”项下供试品制备方法制成阴性对照样品溶液。

2.3 线性关系考察

取“2.2.1”项下0.900 3 mg/mL黄芩苷、0.093 66 mg/mL盐酸小檗碱对照品贮备液,用甲醇稀释至黄芩苷45.0、72.0、108.0、162.1、180.1 μg/mL,盐酸小檗碱4.7、7.5、11.2、16.9、18.7 μg/mL的系列混合对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进行实验,混合对照品溶液进样量各10 μL,记录黄芩苷、盐酸小檗碱色谱峰峰面积。以混合对照品质量浓度(mg/mL)为横坐标X、峰面积(A)为纵坐标Y进行线性回归方程计算,得黄芩苷、盐酸小檗碱回归方程分别为Y=28427X-50.42(r=0.999 2)、Y=19981X+0.5717(r=0.999 8)。结果表明,黄芩苷、盐酸小檗碱检测质量浓度线性范围分别为45.0~180.1、4.7~18.7 μg/mL。

2.4 精密度试验

取半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1 g(批号:20180706),精密称定,按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理,按照“2.1”项下液相色谱条件连续进样6次测定指标成分含量。结果样品中指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.26%、0.43%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1 g(批号:20180706),精密称定,按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理,按照“2.1”项下色谱条件,分别于放置0、2、4、6、8 h时进样测定,记录峰面积,计算指标成分含量。结果样品中指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为 0.58%、0.64%(n=5),表明样品溶液在8 h内基本稳定。

2.6 重复性试验

分别取6份半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1 g(批号:20180706),精密称定,按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理,按照“2.1”项下色谱条件对样品进行含量测定,记录峰面积,计算指标成分含量。结果样品中指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为0.71%、1.32%(n=6),表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

分别取6份半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1 g(批号:20180706),精密称定,置于50 mL容量瓶中,依次加入质量浓度0.7438 mg/mL的黄芩苷对照品溶液3.5 mL、0.234 1 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液1.2 mL,按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理,再按照“2.1”项下色谱条件对样品进行含量测定,同时计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收实验结果 (n=6)

2.8 耐用性试验

按照 “2.2.2”项方法,取同一份半夏泻心汤基准煎剂冻干粉,平行制备 2 份样品,按照“2.1”项下色谱条件,采用不同温度(20℃、25℃、30℃)、不同流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)、同一品牌不同批次的色谱柱(Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL072720、Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL017852)对相同样品进行 HPLC 分析,计算含量,并进行比较。

结果表明,Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL072720柱,流速1 mL/min,不同柱温时,测得半夏泻心汤基准煎剂冻干粉中黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.37%、1.99%,对含量测定无显著影响。不同流速时,测得半夏泻心汤基准煎剂冻干粉中黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.84%、1.82%,对含量测定无显著影响。采用同一品牌不同批号的色谱柱检测半夏泻心汤冻干粉中黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.15%、14.98%,色谱柱变化对盐酸小檗碱含量测定有显著影响,且采用Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL017852色谱柱测的盐酸小檗碱分离度不佳。

2.9 样品含量测定

分别取3批半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1g(批号:20180706、20180708、20180710),精密称定,按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理,再按照“2.1”项下色谱条件对样品进行含量测定,结果见表2。

表2 样品含量测定结果 (n=3,mg/g)

3 讨论

3.1 色谱柱选择

笔者首先探索了DIASONSIL-C18柱对本品指标含量黄芩苷、盐酸小檗碱的分离情况,发现在不同流动相条件下两个成分的峰形不佳,因此换用Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL072720柱进行实验,在此色谱柱条件下黄芩苷、盐酸小檗碱出现较好峰形。

3.2 检测波长选择

对样品进行全波长扫描发现黄芩苷在275 nm处有最大吸收,随着波长的升高或降低,黄芩苷吸收值下降,盐酸小檗碱分别在340 nm和235 nm有最大吸收,又继续考察了235 nm、275 nm、340 nm波长条件下两个指标成分的对称因子、分离度、塔板数等指标,发现275 nm波长条件下分离度、塔板数等均较其他两个波长好,因此选择275nm波长作为本实验的最终波长。

3.3 样品前处理方法考察

试验中对样品前处理方法进行了考察,分别用盐酸-甲醇(1∶100)、50%甲醇、80%甲醇、纯甲醇溶解样品,发现50%甲醇、80%甲醇、纯甲醇溶解样品出现的色谱峰面积没有很大差别,但80%甲醇溶解样品出现的色谱峰分离度均较50%和甲醇溶解高,因此选用80%甲醇提取。

3.4 流动相pH优化

试验中考察了流动相pH的影响:乙腈-0.2%磷酸溶液不调节pH,用三乙胺调pH=2.5,调pH=3等,发现pH=2.5条件下黄芩苷、盐酸小檗碱分离度最好,因此选用乙腈-0.2%磷酸溶液,用三乙胺调pH=2.5。

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