瘦素基因启动子区G-2548A多态性与2型糖尿病肾病的关系

穆立焕，王颖，佟俊旺，金秀平，陈茜，徐谦，杨丽婉，江兰

（1.华北理工大学，河北 唐山 063210；2.华北理工大学附属医院 内分泌科，河北 唐山063000；3.华北理工大学 公共卫生学院，河北 唐山 063210）

国际糖尿病联盟2017年数据表明，全球4.25亿成年人患糖尿病，2.12亿未被确诊，预计2045年将达6.29亿[1]。糖尿病肾病是多基因参与的遗传性疾病[2-3]。高血压、高血脂、高血糖参与糖尿病肾病的发病。近年来多项研究表明，G-2548A多态性与大血管病变有关，但对微血管病变研究甚少，糖尿病肾病属于微血管病变，或许与大血管病变有相同的发病机制。本研究应用分子生物学技术对G-2548A多态性进行研究，旨在探讨该位点多态性与糖尿病肾病的关系，为疾病的早期诊断提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年5月—2017年5月在华北理工大学附属医院内分泌病区住院的2型糖尿病肾病和无糖尿病肾病的2型糖尿病患者416例，均无血缘关系。患者常规降血糖、降血脂、降血压治疗不变。纳入标准：符合1999年世界卫生组织糖尿病诊断标准[3]；排除标准：合并糖尿病酮症等急性并发症、泌尿系感染、其他肾脏相关疾病、心功能不全、恶性肿瘤、妊娠、哺乳期及资料不完整等。通过测定尿微量白蛋白将患者分为两组：无糖尿病肾病组男性102例，女性122例，平均年龄（56.2±11.1）岁；2型糖尿病肾病组男性96例，女性96例，平均年龄（58.3±11.5）岁。两组患者年龄、性别方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经华北理工大学伦理委员会批准（批准号：2016113），所有患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 检测指标 测量身高、体重并计算体重指数（BMI），测量收缩压（SBP）、舒张压（DBP）。采用乳胶凝集反应法测定糖化血红蛋白（HbA1C）（宁波瑞源生物科技有限公司）。应用Olympus AU5400全自动生化分析仪（日本Olympus公司）测定相关血清指标：尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白A、载脂蛋白B。应用酶联免疫法瘦素试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）测定血清瘦素。

1.2.2 分析瘦素基因多态性 抽取空腹静脉血3 ml，应用北京庄盟国际生物基因科技有限公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA，PCR扩增DNA。查找Genebank中瘦素基因组序列，根据文献[4]并使用引物设计软件Premier 5.0优化设计rs7799039位点所在序列引物。基因扩增引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。正向引物：5'GGATGGAGGCCCTAGTGGAA3'，反向引物：5'GAGATTAAAGCAAAGACAGGCA3'。瘦素基因扩增体系：PCR Taq Master Mix 12.5μl，正反向引物各1.0μl，DNA模板1.0μl，双蒸水25μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环，72℃继续延伸5 min。取PCR产物加样于琼脂糖凝胶孔中进行电泳，在紫外透视仪（安庆昌嘉电子产品贸易有限公司）下观察结果并拍照。最后进行酶切（内切酶HhaI由北京睿博兴科生物技术有限公司提供），在紫外透视仪下根据条带位置和数目确定基因型，使用凝胶成像系统照相并保存。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距M（P25，P75）表示，比较用秩和检验；计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较

2型糖尿病肾病组与无糖尿病肾病组患者瘦素、HbA1C、BUN、SCr、收缩压、舒张压比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），2型糖尿病肾病组患者瘦素、HbA1C、BUN、SCr、收缩压、舒张压高于无糖尿病肾病组。两组患者UA、TG、TC、HDL-C、LDL-C、载脂蛋白A、载脂蛋白B比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、2。

表1 两组患者临床资料比较

表2 两组患者血压比较 （mmHg，x±s）

2.2 遗传平衡检验结果

将所有研究对象进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，AA、AG、GG基因型频率分别为68.0%、30.3%和1.7%，A等位基因频率为83.2%，G等位基因频率为16.8%，经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=2.802，P=0.094），该位点基因型和等位基因频率已达Hardy-Weinberg平衡，来自同一群体，具有群体代表性。

2.3 瘦素基因启动子区G-2548A多态性比较

酶切产物电泳后可分为3种基因型，AA、AG和GG（见附图）。两组基因型分布频率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组等位基因分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

附图 瘦素基因启动子区G-2548A多态性电泳图

表3 两组瘦素基因启动子区G-2548A基因型和等位基因的分布频率比较 例（%）

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病慢性并发症之一，也是导致终末期肾衰竭的主要病因之一[5]。至今，糖尿病肾病的发病机制尚不清楚，可能是多因素相互作用的结果[6]。其早期表现为肾小球高灌注、高滤过，然后出现蛋白尿，晚期表现为肾衰竭。JARDINE等[7]研究表明，糖代谢紊乱、高血压、高血脂、糖尿病病程、性别、年龄等与糖尿病肾病的进展相关。本研究结果表明，2型糖尿病肾病组收缩压、舒张压、糖化血红蛋白、BUN、SCr高于无糖尿病肾病组，而两组UA、TG、TC、HDL-C、LDL-C、载脂蛋白A、载脂蛋白B无差别，与JARDINE等[7]的研究结果不完全相同。有研究表明，HbA1C、BUN、SCr、收缩压、舒张压与对照组相比显著升高[8-10]，与本研究结果一致。李泽宇等[10]研究指出，糖尿病组血脂水平与糖尿病肾病组有差别，与本研究结论不同，考虑可能与糖尿病肾病组患者服用降脂药物有关。许多研究发现，由脂肪组织产生的细胞因子在糖尿病肾病的发生、发展中起重要作用，瘦素就是其中之一。MOON等[11]研究发现，瘦素与糖尿病肾病发病有关。段永强等[12]研究表明，病例组与对照组的瘦素水平有差别，与本研究结论一致。瘦素是瘦素基因编码的产物，主要由白色脂肪产生，是脂肪细胞分泌的肽类激素，由167个氨基酸组成，在调节机体能量平衡、体重及许多生理代谢方面起重要作用。MÜNZHERG等[13]研究指出，瘦素促进细胞修复及血管形成。瘦素分泌受多种因素影响，其中基因调控区变异也是影响因素之一。瘦素基因启动子区G-2548A是较常见的单核苷酸多态性。有研究者称该单核苷酸多态性或许从转录水平影响瘦素基因的表达及循环瘦素的高低[14]。王立坤等[15]研究表明，瘦素在糖尿病微血管病变形成过程中起重要作用。瘦素和瘦素受体基因多个位点存在多态性，许多研究证实，该基因多态性参与多种疾病的发生、发展[14-15]。目前国内外对瘦素基因启动子区G-2548A基因多态性相关疾病，如冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）、高血压等都有研究，但对2型糖尿病肾病研究甚少。谭艺青等[16]研究表明，瘦素rs4731426、rs2167270基因多态性与我国南方汉族人群冠心病无关联。翟公伟[17]研究表明，瘦素基因启动子-2548G/A存在不同的基因型，早发冠心病组与正常对照组基因型分布不同，该位点多态性与冠心病发病有关，其中A等位基因可能是其发病的遗传易感基因。本研究以瘦素基因启动子区G-2548A基因变异作为标记，探讨该基因的变异和2型糖尿病肾病易感性的关系。本研究发现无糖尿病肾病患者与2型糖尿病肾病患者瘦素基因启动子区G-2548A基因多态性分布有差异，其中2型糖尿病肾病患者AA、AG基因型频率和A等位基因的分布频率较无糖尿病肾病组升高。

综上所述，瘦素基因启动子区G-2548A多态性与2型糖尿病肾病患者有一定的相关性，A等位基因可能是其发病的易感基因。通过检测基因型和等位基因频率可以筛查2型糖尿病肾病。由于本研究样本量小，尚需进行大样本研究来证实，同时本研究为病例对照研究，验证因果关联能力弱，尚需前瞻性研究弥补不足。