HSPA9、Beclin-1在甲状腺滤泡癌中的表达及其相关性分析

蔺广荣，刘克毅，李纪男，何转丽，霍建平，柴芳

（锦州医科大学附属第一医院 甲状腺外科，辽宁 锦州 121001）

近年来，甲状腺癌的发病率快速上升，成为最常见的恶性肿瘤之一[1]。其中甲状腺滤泡癌（follicular thyroid carcinoma, FTC）是继甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma, PTC）之后的常见甲状腺癌，约占10%，转运途径以血运转移为主，易发生远处转移，其侵袭性、转移率及病死率均高于PTC[2]。根据侵袭程度分为广泛侵入型甲状腺滤泡癌（widely invasive follicular thyroid carcinoma, WIFTC）和微小侵入型甲状腺滤泡癌（minimally invasive follicular thyroid carcinoma, MIFTC），两者预后差异明显[3]。热休克蛋白A9（heat shock protein, HSPA9）是一种高度保守的分子伴侣蛋白，在肿瘤的侵袭、转移中发挥重要的作用[4]。Beclin-1属于自噬相关蛋白，在细胞的自噬过程中起着重要的调控作用。笔者拟对HSPA9、Beclin-1蛋白在FTC中的表达情况进行分析，对其临床病理意义进行探讨，同时分析两者在FTC中表达的相关性，为临床寻求新的治疗靶点提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2000年1月—2017年12月锦州医科大学附属第一医院收治的FTC患者57例，取其癌组织及其癌旁组织（距病灶≤2 cm）。其中，男性18例，女性39例；年龄22～72岁，平均（49.5±18.1）岁。纳入标准：①病理诊断由2位高年资的病理医生共同确诊；②无甲状腺癌家族遗传史；③术前未行内分泌治疗及放化疗；④无合并桥本氏病等甲状腺相关疾病；⑤临床分期按照2010年美国癌症联合会分期。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

采用免疫组织化学SABC法。组织经10%甲醛固定后脱水、包埋，切片厚度4μm，检测HSPA9、Beclin-1蛋白表达。一抗均按1∶100稀释，按试剂盒说明书操作，微波修复，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，之后进行血清封闭。依次加入一抗、二抗及SABC，DAB显色，苏木精复染，常规脱水，透明，中性树胶封片。PBS取代一抗作为阴性对照。

1.3 主要试剂

兔抗人HSPA9（WL03209）、兔抗人Beclin-1（WL02237）单克隆抗体及即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.4 判断标准

实验染色结果由2位经验丰富的病理科医生采用双盲法独立阅片。根据染色强度和阳性细胞百分比来评分。HSPA9及Beclin-1染色部位均为细胞质或细胞膜。以出现棕黄色颗粒沉淀为阳性表达。强度评分为0（无染色）、1（浅黄色）、2（棕黄色）及3分（棕褐色）。比例积分为0（＜5%阳性细胞）、1（5%～＜25%阳性细胞）、2（25%～＜50%阳性细胞）、3（50%～＜75%阳性细胞）和4分（75%阳性细胞）。强度评分和比例积分相乘产生最终的染色评分：0分为阴性（-）；1～4分为弱阳性（+）；5～8分为阳性（++）；9～12分为强阳性（+++）。在统计学分析中，（-）或（+）最后染色评分被合并为阴性表达，（++）或（+++）最后评分被合并为阳性表达。见图1、2。

图1 FTC组织中HSPA9和Beclin-1的表达（SABC×400）

图2 癌旁组织中HSPA9和Beclin-1的表达（SABC×400）

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验或Fisher确切概率法，等级相关分析采用Spearman法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FTC及其癌旁组织中HSPA9、Beclin-1蛋白阳性表达率比较

FTC组织中HSPA9阳性表达43例（75.44%），癌旁组织中HSPA9阳性表达9例（15.79%），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=40.876，P=0.000）。FTC组织中Beclin-1阳性表达35例（61.40%），癌旁组织中Beclin-1阳性表达10例（17.54%），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=22.947，P=0.000）。

2.2 HSPA9、Beclin-1蛋白表达与FTC临床病理参数的关系

不同病理类型、是否远处转移患者的HSPA9阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同病理类型患者的Beclin-1阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见附表。

2.3 FTC组织中HSPA9与Beclin-1蛋白表达的相关性

FTC组织中HSPA9与Beclin-1共同阳性34例，共同阴性13例，HSPA9阳性而Beclin-1阴性9例，HSPA9阴性而Beclin-1阳性1例。HSPA9与Beclin-1蛋白表达呈正相关（rs=0.636，P=0.000）。

附表 HSPA9、Beclin-1蛋白表达与FTC临床病理参数的关系 例（%）

3 讨论

自噬是溶酶体介导的细胞内分解代谢过程，在营养缺乏、缺氧和DNA损伤的情况下，激活细胞自噬以促进细胞质组分的降解[5]。目前越来越多的文献支持自噬在肿瘤的发生、发展过程中起重要的作用[6-7]。自噬相关蛋白在参与调节自噬的启动、延长和成熟的过程中发挥重要作用。Beclin-1是自噬通路的重要调节器，与多种肿瘤的发生、发展相关。本研究发现，Beclin-1在FTC中阳性表达35例（61.40%），癌旁组织中阳性表达10例（17.54%），两者比较有差异，进而推测自噬参与FTC的发生，这一点与既往研究一致[8]。本研究还发现27例WIFTC患者中Beclin-1阳性表达22例（81.48%），30例MIFTC患者中Beclin-1阳性表达13例（43.33%），两者比较有差异，提示自噬可能参与FTC的发展。笔者推测肿瘤的生存状态与自噬密切程度有关。随着肿瘤侵袭力的增强，自噬可能帮助肿瘤细胞摆脱应激环境，来促进肿瘤的生长。尽管没有发现Beclin-1的表达与远处转移存在相关性，但是笔者考虑主要与纳入的研究对象例数有关。有研究表明，自噬是髓样癌肿瘤细胞的生存机制[9]。也有学者认为，自噬活性的下降与PTC的发生与发展有关[10]。笔者认为自噬在不同病理类型的甲状腺癌中的发病机制可能不同。目前自噬相关蛋白在FTC中研究较少，还需要更多的研究验证自噬在FTC中的发病机制。

HSPA9是热休克蛋白70的家族成员之一，在细胞周期调控方面起着重要作用[11-12]。本研究选取18例有转移的FTC患者，结果阳性率为100%。HSPA9在27例WIFTC患者中阳性表达25例（92.59%），30例MIFTC患者中阳性表达18例（60.00%），两者比较有差异。笔者推测，HSPA9在FTC侵袭转移中扮演重要的角色。STARENKI等[13]用免疫组织化学法检测46例正常甲状腺组织和38例甲状腺髓样癌患者组织中HSPA9的表达情况，发现在癌组织中表达高于癌旁组织，认为HSPA9可作为甲状腺髓样癌的一个新治疗靶点。本研究发现，HSPA9在癌组织中表达高于癌旁组织，笔者认为HSPA9也可作为FTC的治疗靶点。康强等[14]研究发现，通过siRNA沉默HSPA9表达可抑制人肝癌细胞HCCLM3增殖活性，认为HSPA9可以作为肝细胞癌潜在的治疗靶点。ANDO等[15]发现，HSPA9不仅可作为胃癌的治疗靶点，而且是一个很好的评估胃癌预后的分子。HSPA9参与肿瘤的发生、发展，并有望成为多种肿瘤的治疗靶点。

HSPA9可通过Raf/Mek/Erk1/2信号通路来促进Bcl-2的表达[16]。Bcl-2蛋白通过与自噬相关蛋白Beclin-1共有的BH3结构域相互作用，参与自噬的调控[17]。笔者推测，HSPA9可能通过Raf/Mek/Erk1/2信号通路调节自噬活性，并参与FTC的发生、发展。有研究发现，HSPA9通过PI3K-Akt和JAK-STAT信号通路加速乳腺癌侵袭与转移[18]。还有研究发现，HSPA9通过MAPK-ERK信号通路参与卵巢癌的发生、发展[19]。由此可见，HSPA9参与肿瘤发生、发展的多个环节。

综上所述，本研究提示HSPA9和Beclin-1蛋白可能与FTC的发生、发展密切相关，为FTC提供新的治疗靶点，但其具体机制尚待进一步研究证实。