循环肿瘤细胞在癌症治疗中的研究进展*

郭文慧， 潘云， 李艳△

1大理大学基础医学院病理学教研室(云南大理 671000)； 2大理大学附属医院病理科(云南大理 671000)

转移是大多数癌症患者预后不良和癌症相关性死亡的主要原因,是由Ashworth[1]首次提出的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)离开原发和(或)继发肿瘤微环境，并渗入循环系统和淋巴系统而引起，所以针对CTCs的检测和治疗受到了研究者的广泛关注。但因CTCs富集技术的缺乏，其应用一直受到限制。直到近20年间，随着CTCs分离纯化技术的不断发展和成熟，其潜在临床应用才逐渐被发掘出来。近年来，大量研究已表明CTCs检测可用于辅助癌症的早期诊断、预测预后及监测复发和转移，可很好地反映肿瘤的发生、发展、转移和复发等情况。美国FDA已批准使用CellSearch计数CTCs作为监测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌无进展生存期(progression free survival，PFS)和总生存期(overall survival，OS)的预后生物标志物。还有研究也表明CTCs分析可用于检测各种癌症的早期肿瘤进展，如乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌等[2-5]。但CTCs在癌症治疗中的研究，国内已报道的综述文献大多是关于CTCs计数对治疗疗效的监测评估，本文就CTCs的分子分析和靶向CTCs两方面对癌症治疗的研究进展作一综述，其主要内容为：通过追踪CTCs的分子生物学变化，揭示重要的抗肿瘤药物敏感性信息和耐药情况，在个性化基础上，实现治疗方案的迅速调整；通过靶向转移过程中CTCs，干扰肿瘤细胞的转移或影响CTCs回巢后的肿瘤生长，改善患者预后或减少转移相关性癌症死亡，为下一代癌症患者抗转移治疗的发展提供可能。

1 CTCs指导个体化医疗

传统活检和影像成像是诊断肿瘤最常用的方法，一直以来，治疗方案的选择都脱离不了实体肿瘤病灶检查的局限性[6]。但CTCs作为肿瘤转移的“种子”，存在于血液循环系统中，可被简便、微创和可重复性地检查，解决了以上局限。另外，常常在治疗初期各抗肿瘤药物的疗效较好，可最终大部分肿瘤产生了耐药性，而耐药突变的出现往往造成患者的预后不良。CTCs分析的发展，可通过检测CTCs的DNA、RNA和蛋白质组分实时监测肿瘤进展，为针对肿瘤产生的新突变和随之产生的耐药性，确定最有效的治疗方案。再者，近年来随着CTCs体内外细胞培养技术的不断发展，使基于CTCs的药敏实验成为可能，从而大大提高了治疗方案的有效性。

1.1 通过检测CTCs的分子生物学特性制定和调整治疗方案 曲妥珠单抗作为乳腺癌患者的靶向药物，目前，只是HER-2扩增型乳腺癌标准治疗的部分，但从CTCs分子分析的角度来看，原发性HER-2阴性乳腺癌也可能从中受益。大量研究表明，在原发性HER-2阴性乳腺癌患者中，可检测到HER-2阳性的CTCs[7-8]。2期临床试验就以CTCs HER-2基因扩增为依据，对原发性HER-2阴性的乳腺癌患者进行实验性曲妥珠单抗治疗，发现其可延长此类患者的PFS[9]。前瞻性3期临床试验正在进行，设置标准治疗组和标准治疗联合拉帕替尼(HER-2蛋白酪氨酸激酶抑制剂)治疗组，来探讨原发性HER-2阴性、CTCs HER-2阳性乳腺癌患者能否从抗HER-2治疗中获益[10]。如果可以，则CTCs HER-2的基因或蛋白分子检测就可为乳腺癌的患者提供更全面的治疗策略。除HER-2外，Mazel等[11]首次在乳腺癌的CTCs中检查到细胞程式死亡-1(PD-L1)，此为肿瘤免疫治疗的靶点，可为患者选择免疫疗法，并在免疫治疗期间实现实时监测。Paoletti等[12]也通过监测CTCs中ER的基因及表达情况，来作为乳腺癌内分泌治疗的工具。

吉非替尼是非小细胞肺癌(NSCLC)的一线靶向药物，可选择性抑制表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶。目前，研究发现吉非替尼耐药的NSCLC中有50%归因于EGFR T790M突变[13]。Jiang等[14]在NSCLC患者的原发组织和CTCs中测定了EGFR的特定突变位点：19-Del、L858R、T790M、20-Ins、G719X、S768I和L861Q，发现两者中EGFR的突变几乎一致，且发现吉非替尼治疗有效或成功的患者，CTCs EGFR中无T790M突变，而耐药患者CTCs中可检出T790M突变。此实验揭示了CTCs检测可代替原发组织活检，通过测定CTCs EGFR突变，可及时调整靶向治疗方案，避免无效治疗。除EGFR亚型外，间变性淋巴瘤激酶(ALK)重排是NSCLC的又一不同亚型。Kim等[15]使用荧光原位杂交技术(FISH)检测了ALK重排NSCLC患者中的CTCs，发现分析CTCs中的ALK重排可能是预测ALK抑制剂克唑替尼耐药性和选择色瑞替尼(克唑替尼耐药患者的ALK抑制剂)治疗的有用方法。Ilié等[16]研究了CTCs和循环白细胞中的PD-L1状态，发现与肿瘤组织中的PD-L1状态相关，揭示了连续CTCs监测在肿瘤免疫疗法选择中的重要作用。

除以上介绍的乳腺癌和NSCLC外，CTCs的分子生物学特性检测在其他癌症中也有类似的作用。如在卵巢癌的铂类耐药患者中，外周CTCs中可检出一组与化疗耐药相关的蛋白，即多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-related proteins 1～10，MRP 1～10)和核糖核苷酸还原酶亚基 M1(ribonucleotide reductase subunit M1，RRM1)，这组蛋白可为治疗耐药性卵巢癌提供前景靶点[17]。再者，Braun等[18]首次证实了EGFR蛋白在肉瘤患者CTCs中的表达，表明了可通过随访CTCs中EGFR的表达情况来评估靶向EGFR治疗的疗效，为疾病过程中及时调整患者的治疗方案做准备。

1.2 通过CTCs细胞培养的药敏测试 研究表明，在乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和肺癌中已经建立了CTCs细胞系[19-22]，且有些亚型可以在小鼠的临床实验中致瘤。2014年，Yu等[20]报道了一项具有里程碑意义的研究，他们在6例患有ER阳性乳腺癌的患者中分离出CTCs，通过体外悬浮培养，建立了CTCs细胞系和小鼠原位移植瘤模型。又采用体外细胞培养药敏试验和DNA二代测序，证实了CTCs中PIK3CA突变者对BYL719敏感，FGFR2突变者对AZD4547敏感，ESR1突变者对他莫昔芬及氟维司群均耐药，但联合HSP90抑制剂则可取得很好的效果。此结果揭示了乳腺癌药物敏感性与CTCs 基因突变的相关性，可以帮助鉴定个体乳腺癌患者在其疾病过程中的最佳疗法。2015年，Cayrefourcq等[21]成功培育出结直肠癌CTCs的第1株永久细胞株，且在免疫缺陷小鼠中形成了异种移植肿瘤，为进一步体内外进行大量药敏测试的功能研究提供了条件，将更好地实现个体化精准医疗。另外，Zhang等[23]利用芯片捕获的肝癌CTCs在三维细胞培养试验中扩增形成了球状结构，且在药敏测试中发现了索拉非尼或奥沙利铂可显著地抑制CTCs的克隆。此外，在一项预测和评估紫杉醇-卡铂治疗上皮性卵巢癌疗效的研究中，研究者利用体外培养CTCs测试药敏来评估CTCs对紫杉醇-卡铂的敏感度与患者疗效反应之间的相关性。根据患者的治疗史和随访可知，当CTCs对紫杉醇-卡铂敏感时，患者病情缓解或对化疗有反应；而当CTCs对紫杉醇-卡铂耐药时，患者复发[24]。此实验表明可通过体外CTCs的药敏实验来评估疗效并及时为疾病过程中的个体患者更换疗法。

2 针对CTCs的癌症治疗方法

CTCs处在整个转移扩散过程的中心环节上，若将其作为一个新靶点，可干扰癌症的转移，为癌症治疗提供新方案。

2.1 靶向清除CTCs 自然杀伤细胞表面的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)可以诱导肿瘤细胞的凋亡，这是机体对肿瘤发生的重要免疫手段。通过把TRAIL修饰的脂质体整合到与CTCs结合的循环细胞和血液成分中，从而诱导CTCs的凋亡是一种肿瘤治疗的新尝试。Wayne等[25]把修饰的脂质体附着到循环白细胞上，使这些白细胞变成循环系统内的“非自然杀伤细胞”，诱导它们接触的CTCs发生凋亡。Li等[26]通过同样的方法，依据CTCs与血小板的相互作用，建立了血小板靶向脂质体。他们通过功能化转移性乳腺癌模型小鼠中的血小板以清除CTCs，结果发现血小板上表达TRAIL的小鼠肺转移明显减少。同样地，Chandrasekaran等[27]创建了TRAIL修饰的NK细胞脂质体，以增强NK细胞的内在肿瘤抑制能力，使NK细胞对CTCs的杀伤力增强，并有效地防止原发性肿瘤的转移性扩散。

最近的研究发现，纳米激光探针可检测和追踪循环中的CTCs，并可通过发射高功率激光脉冲杀灭CTCs，但不会对正常细胞造成破坏，这可有效控制癌症转移，有望成为减少转移相关性癌症死亡的前景手段[28]。然而，这种创新方法的可行性和安全性，还需要未来临床试验的证明。特别是，评估杀死转运CTCs是否对已建立的临床结果参数，如PFS和OS有影响。可以设想，对于不可手术但没有总转移迹象的癌症患者来说，杀灭CTCs、停止进一步血液播散可能会使其受益。另外，Mirza等[29]的研究也表明，姜黄素可通过诱导DNA损伤或抑制DNA修复靶向循环肺癌干细胞，从而减缓NSCLC的疾病进展和转移。

2.2 通过CTCs杀死原发和转移肿瘤细胞 最近的研究表明，CTCs可以从原发性或转移性病灶转移到外周血，然后通过称为“自我播种”的过程回到原发肿瘤或继发肿瘤，从而促进原发性肿瘤生长和继发性转移性传播[30]。Dondossola等[31]利用了这种生物学属性，将肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通过CTCs直接传递给原发性和转移性肿瘤，来实现“肿瘤自我靶向”。他们通过基因工程的设计，使从乳腺癌、黑素瘤和Lewis肺癌小鼠中提取的CTCs表达TNF-α，然后回输到小鼠体内，在一系列干预试验后，观察到CTCs可以定位到肿瘤上，且在表达TNF-α的肿瘤细胞小鼠中发现，原发性肿瘤灶和转移性集落的生长有所减缓或减少。此实验虽然在其他许多肿瘤模型中还未进行过测试，但也给以CTCs为中介的癌症治疗带来了曙光。

3 展望

以上主要论述了CTCs分析在个体化医疗中的贡献，以及CTCs作为靶点在癌症治疗中的潜力。未来该领域的发展，需要改善培养环境来体外培养各种肿瘤CTCs，实现CTCs高通量基因突变分析，建立CTCs亚型的转移性动物模型，为克服耐药性、推定新药疗效及早期临床试验机制提供证据，为药物干扰转移试验提供实验对象，潜在地推动转移过程中的癌症治疗的进一步发展。除此以外，CTCs在临床早期诊断中的作用也是一大热点，尤其是肿瘤的定位诊断。众所周知，现有CTCs的化学富集是通过一些在血细胞中不表达，但在肿瘤细胞上阳性表达的上皮细胞表型来实现，但却不能鉴定所捕获CTCs的组织与器官来源。Lu等[32]把常规用来鉴定特定肿瘤起源的不同种类标记物，应用于CTCs表征，将从肺癌、结肠直肠癌和前列腺癌外周血中捕获的CTCs洗脱至由6组抗体组成的免疫荧光染色组：anti-panCK、anti-CK18、anti-CK7、anti-TTF-1、anti-CK20/anti-CDX2、and anti-PSA/anti-PSMA。结果发现，CK7+或TTF-1+、CK20/CDX2+和PSA/PSMA+的CTCs分别对应于肺癌、结肠直肠癌或前列腺癌，给早期确诊肿瘤原发灶带来了新的可能。未来可在此基础上发展敏感度、特异度高的技术方法，来实现早期、精准诊断肿瘤，提高患者的治愈率及降低病死率。