卵 巢 早 衰 的 细 胞 疗 法 研 究 进 展▲

黄秋艳 杨一华 谭 莹 刘 博 覃爱平

(广西医科大学第一附属医院生殖中心，南宁市 530021，电子邮箱：445642639@qq.com)

【提要】 卵巢早衰的发病率呈逐年上升趋势，从根本上修复卵巢早衰患者的卵巢功能，解决其生育问题是生殖医学的难点。近年来，有学者尝试使用细胞疗法治疗卵巢早衰，取得一定的效果。本文就卵巢早衰相关细胞疗法的种类、机制、效果及存在的问题进行综述。

卵巢早衰指女性在40岁前发生卵巢功能衰竭，出现原发性或者继发性闭经，伴有促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，以及围绝经期表现等[1]，被认为是早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)中病情最严重的亚型[2]。全球40岁以下的女性人群中，约1%受卵巢早衰困扰[2-3]。卵巢早衰是导致女性不孕的重要疾病之一，其病因包括染色体异常、放化疗损伤、卵巢手术操作史、代谢异常、免疫调节异常、氧化应激、环境因素等[1，4-5]，目前最常见的治疗方法为补充激素治疗[1]，但是该方法无法解决患者的生育问题，还导致部分患者乳腺癌等疾病的发病风险增加[6]。其他方法包括心理支持、脱氢表雄酮、辅酶Q、褪黑素、免疫治疗以及改善生活方式等，但均不能从根本上修复卵巢功能，常需要借助赠卵来解决患者生育问题[5]。近年来，有学者使用以干细胞为核心的细胞疗法治疗卵巢早衰及POI，取得一定疗效[7-8]，包括间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)、人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC)、卵巢生殖干细胞(ovarian germline stem cell,OGSC)、胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)以及单核细胞等。本文就相关细胞疗法治疗卵巢早衰的研究进展进行综述。

1 MSC

MSC是来源于中胚层中具有多向分化潜能的成体干细胞，最早被发现于骨髓中[9]，其具有多向分化、造血支持、低免疫原性、旁分泌及“归巢”等特点[10]，可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和生殖细胞等[9]。MSC治疗卵巢早衰的机制主要有：(1)在添加各类生长因子例如视黄酸、骨形态发生蛋白4、骨形态发生蛋白8b及转录生长因子β1共培养条件下，MSC可分化成生殖样细胞[7]。研究发现，移植骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)可归巢至受损部位，其可分化成为新的颗粒细胞或者具有分泌营养功能的生殖细胞，而不是卵母细胞[8]，但是MSC可能参与了卵母细胞的修复和合成[11]；(2)MSC通过上调B淋巴细胞瘤2[12]，下调B淋巴细胞瘤2相关X蛋白、半胱氨酸蛋白酶3[12-13]和半胱氨酸蛋白酶9[14]的表达，减少颗粒细胞的凋亡；(3)MSC旁分泌各种细胞生长因子如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、转化生长因子β等，与细胞的存活、增殖、迁移以及血管的形成等有关[8，12，15-16]；(4)MSC可促进调节性T淋巴细胞的分化而在免疫抑制中发挥重要作用[17]；(6)MSC有助于卵巢抗氧化、抗纤维化[8，16]。研究表明，MSC具有向损伤组织迁移并定植(即“归巢”)的特点，“归巢”后可修复组织功能[11，18-19]，静脉注射和卵巢原位注射MSC均能修复卵巢早衰所致的内分泌紊乱[11，20]。目前用于治疗卵巢早衰的MSC细胞主要有以下几类。

1.1 BMMSC BMMSC来源于骨髓内，是最早发现的MSC[9，21]。BMMSC具有良好的分化性能及低免疫原性，采集便利，目前将其用于促进生育力恢复的研究较多[7-8]，且其在卵巢早衰的治疗中取得较好效果[8]。Edessy等[22]报告，一名染色体异常所致卵巢早衰患者接受BMMSC卵巢体内移植后成功妊娠。但也有研究显示，随着年龄增长，BMMSC的细胞数量和扩增分化能力呈下降趋势[21]，且骨髓穿刺为有创性操作，会增加患者疼痛、感染等风险。

1.2 人脐带间充质干细胞 脐带血内含有胎儿生长发育期间产生的多种未成熟细胞，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell，HUC-MSC)主要来源于脐带组织或脐带血，取材方便，对供者无不利影响，便于保存，道德伦理限制性小，且与输注干细胞相关的病毒和病原微生物感染率远低于BMMSC[13]。HUC-MSC低表达主要组织相容性复合体Ⅰ，不表达主要组织相容性复合体Ⅱ，因此具有低免疫原性[23]。孙海翔等[24]将HUC-MSC移植入6例卵巢早衰患者，其中有1例在术后1个月开始恢复排卵，并自然受孕分娩1名健康婴儿。

1.3 脂肪间充质干细胞 脂肪组织具有来源丰富、取材损伤小、低免疫原性、稳定增殖等优点[25]。多项卵巢早衰动物模型研究证实，脂肪间充质干细胞治疗卵巢早衰的效果较好[11，26-27]。体外研究表明，人源脂肪间充质干细胞联合雌激素可促进POI患者外周血中调节性T淋巴细胞的分化[28]。Fang等[29]研究报道，将自体脂肪间充质干细胞经阴道腹腔镜注入4例卵巢早衰患者卵巢中，术后有2例患者恢复排卵，尿促卵泡素下降，雌二醇升高。

1.4 月经血来源间充质干细胞 月经血收集方便且无创，月经血来源间充质干细胞具有与其他MSC一样的特性，包括自我更新、高增殖率和多分化能力[30]。部分动物研究证实，月经血来源间充质干细胞可促进卵巢早衰模型动物卵巢功能的恢复[16，31]。但因月经血采集多为供体自行采集，阴道解剖环境的特点增加了月经血来源间充质干细胞制备过程中的生物污染风险。目前相关的研究主要集中在动物研究，尚未见相关临床研究报道。

1.5 其他来源MSC 其他来源的MSC如人胎盘间充质干细胞[17，19]、人羊膜间充质细胞[32]、皮肤间充质干细胞[33]等，移植后均有助于卵巢早衰动物模型卵巢功能的恢复，但均未进入临床相关研究。

2 单核细胞

单核细胞富含造血干细胞、内皮祖细胞等，有助于组织再生，可用于组织器官再生及修复、促进血管新生、改善局部微环境及内分泌组织的功能等[34-35]。研究表明，单核细胞有助于卵泡再生，可诱导新的卵巢生殖细胞发展至减数分裂阶段及形成颗粒细胞[36]。临床研究中，MSC需体外扩增培养或通过特殊细胞分子标志物，借助免疫磁珠、流式细胞分选等萃取[9]；而单核细胞制备快捷，无须体外扩增，能实现自体移植，临床应用及推广空间较大，近年来相关研究亦较多，包括应用于缺氧性脑瘫[37]、缺血性心脏疾病[38]、肢体缺血[39]等。

2.1 骨髓单核细胞 骨髓单核细胞又称为骨髓源干细胞(bone marrow-derived stem cell，BMDSC)，一般采用Ficoll分离液等自骨髓液分离制备。动物研究显示，将BMDSC经尾静脉注入化疗所致卵巢早衰的小鼠体内，可产生不成熟的卵泡[40]。Herraiz等[41]将粒细胞集落刺激因子动员后的人源性BMDSC注入卵巢早衰小鼠的卵巢组织，可产生高质量的排卵前卵泡、二级优胚、2细胞胚胎以及健康的子代。有研究报道，一名45岁POI患者经腹腔镜下移植自体BMDSC，术后2个月恢复自然排卵，行体外受精-胚胎移植后成功妊娠并分娩一名健康男婴[35]。

2.2 外周血单核细胞 外周血单核细胞由外周血分离提取，正常外周血中含有极少量的干细胞，粒细胞集落刺激因子可将骨髓内祖细胞动员至外周血循环中[42]，动员后采集的外周血单核细胞内含有造血干细胞、MSC、内皮祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、成纤维细胞等[34]。El Andaloussi等[43]将粒细胞集落刺激因子动员的外周血单核细胞经静脉输注入卵巢早衰小鼠后，小鼠体内与卵巢修复相关的标志物CD34、血管内皮生长因子等表达上调，动情周期改善、卵泡发育增多，生育力恢复且产仔数量明显增加，与BMDSC作用类似。本课题组前期研究显示，粒细胞集落刺激因子动员的外周血单核细胞经卵巢注射移植入POI大鼠，可使大鼠颗粒细胞的凋亡减少，卵巢血管新生增加，窦前卵泡发育增多，有助于卵巢功能恢复[44]。

2.3 脐带血单核细胞 脐带血富含多种未成熟细胞[13]。Dang等[45]将人源脐带血单核细胞成功移植入卵巢早衰裸鼠的卵巢中，4周后观察到小鼠卵泡增多，性激素水平改善，卵巢功能恢复，但是脐带血单核细胞含有的细胞成分较多，异体移植免疫排斥反应大。

3 hiPSC

hiPSC与ESC具有相似的多向分化潜能。Liu等[46]采用多种细胞生长因子和雌激素诱导hiPSC体外分化为卵巢颗粒样细胞，然后移植入卵巢早衰小鼠，其可以促进卵巢组织的修复及卵泡的发育。hiPSC需要在体外扩增培养、添加诱导因子等，目前临床上将hiPSC用于治疗卵巢早衰的研究较少。

4 OGSC

在小鼠、大鼠、人类中均存在OGSC[47]。Wu等[48]用免疫磁珠法提取5日龄小鼠的OGSC并移植入卵巢早衰小鼠的卵巢中，观察到供体的OGSC归巢到卵巢皮质边缘后分化为早期卵母细胞，随后产生修复卵巢功能的作用，最终恢复怀孕并产下健康的子代。关于OGSC的相关研究结果颠覆了既往传统的卵巢内无生殖干细胞的观点，但目前相关研究仍较少，今后还需进一步研究探讨。

5 ESC

因伦理争议较大，近年来卵巢早衰与ESC相关的研究相对较少。有学者发现羊水间充质干细胞表达ESC的标志物(八聚体结合转录因子4)，且羊水间充质干细胞的增殖速度比MSC快，将羊水间充质干细胞移植入卵巢早衰小鼠可减少颗粒细胞的凋亡[49]。羊膜表皮细胞亦可通过旁分泌等改善卵巢功能[50]。羊水间充质干细胞和羊膜表皮细胞的伦理限制相对较小，但是与羊膜间充质细胞相比，羊膜表皮细胞更易引起免疫排斥反应，且其改善卵巢功能的效果不如羊膜间充质细胞明显[32]。

6 小 结

目前卵巢早衰的各类细胞疗法的治疗仍集中在动物实验，其在临床研究中取得的成果有限，更多的研究还在探索中。目前已报道的研究中，未出现不良反应及安全问题报道，经细胞疗法治疗后所生育的子代亦未见畸形及其他不良影响报道，但是今后的卵巢早衰细胞疗法仍需关注以下问题：(1)目前仍缺乏细胞疗法的计数、使用剂量、细胞活力检测、使用途径的优化研究，各类临床试验的剂量迥异，未来可尝试选择采集更方便、效果更优的细胞治疗方法，以及更高效的干预方法等；(2)免疫排斥反应，异体细胞移植排斥反应大，自体细胞移植能最大限度减少排斥反应的发生[8]；(3)保存一定数量的细胞且具有较高的细胞活力是细胞治疗成功的关键，在临床实践中需探索如何减少制备时细胞的损耗、污染以及其他可能影响细胞活力的因素；(4)现有的各项研究多为小样本、分散的研究，观察周期较短，今后细胞治疗卵巢早衰的进一步推广及应用需更大样本以及更长时间的研究数据支持。