DNA甲基化与口腔疾病的研究进展

原振英 管翠强 南欣荣,

1.山西医科大学口腔医学院·口腔医院 太原 030001；

2.山西医科大学第一医院口腔科 太原 030001

环境因素和遗传多态性导致甲基化异常，异常的DNA甲基化水平与常见的口腔疾病相关，成为研究口腔疾病机制的热点。

1 DNA甲基化与表观遗传学

表观遗传学是研究在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传性变化的遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，包括DNA甲基化（DNA methylation）、组蛋白修饰和非编码RNA调节等[1]。表观遗传学调控机制对细胞分化至关重要，这一过程在每个特定生物体的细胞水平是高度保守的[2]。当这种高度保守的过程直接或间接地受到外部环境影响时，就会导致基因表达的改变，从而导致功能的改变[3]。例如，人类CD4+T细胞的分化受局部炎性物质的影响，这些炎症物质或白细胞介素（interleukin，IL）进一步激活转录因子，这些转录因子与特定基因的启动子区域中特定的甲基化或去甲基化位点结合，形成T细胞DNA，并决定T细胞发展谱系的命运。在特定基因启动子区域附近DNA甲基化的增加导致T细胞表达减少，反之亦然[4]。同样，在牙周炎等病理情况下，局部免疫反应由这些局部作用的转录因子和特定基因的甲基化或去甲基化决定[5]。

2 DNA甲基化与转录调节

DNA甲基化是一种DNA复制后的酶促反应过程[6]，是指生物体在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基转移到DNA分子中胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。随着DNA分子引入甲基，DNA分子的构象改变，影响了DNA与蛋白质因子（如拓扑异构酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等）的结合[7]。哺乳动物基因组中5-甲基胞嘧啶的含量占总胞嘧啶的2%～7%，并集中在二核苷酸胞嘧啶（CpG）结构中[8]。

CpG位点以2种形式存在，一种是CpG结构在DNA中散在分布，每50～100 bp DNA中出现1个CpG，其中约70%的CpG位点中的胞嘧啶是甲基化的；另一种是CpG结构高度聚集在一起，即CpG岛，仅占总DNA的1%～2%，长度为0.2～2 kb，位于基因的5’端启动子区或延伸至第一外显子区[9]。除X染色体基因、印迹基因之外，通常情况下CpG岛不发生甲基化修饰。

CpG岛甲基化与基因的表达密切相关[10]，可以抑制基因的表达，如在肿瘤发生机制中抑癌基因呈甲基化状态[11]，导致抑癌基因失活。CpG岛甲基化抑制基因表达的机制包括：1）CpG岛甲基化改变了DNA分子构象，导致某些重要基团的隐蔽，直接干扰转录因子与调控区DNA结合。2）甲基化CpG与甲基化CpG结合区蛋白结合形成复合物，后者再募集组蛋白去乙酰酶形成复合物，结果使核心组蛋白尾区去乙酰化，形成更紧密的染色质结构，限制了转录因子到达其结合部位的通道，从而抑制基因转录[9]。在高等真核生物中，DNA甲基化可能参与基因的表达调控、发育调节、基因组印记和X染色体失活[12]。

3 DNA甲基化与口腔疾病

多种细菌和病毒可能导致口腔组织的DNA高度甲基化[13]。在口腔炎性疾病组织中，可以观察到异常的DNA高度甲基化[14]。

3.1 DNA甲基化与慢性牙周炎

牙周病是一种由多种微生物感染引起的炎症性疾病，其特点是牙周病原体与宿主免疫反应的相互作用。慢性牙周炎是最常见的一类牙周病[15]。

有研究[16]表明，表观遗传修饰在调节宿主免疫反应方面起着至关重要的作用，可能通过影响参与免疫反应的基因表达来促进疾病的发生和发展。由于局部免疫反应受到炎症位点的表观遗传调控，所以在同一个体中炎症位点与非炎症位点的表观基因组存在差异。与健康人的DNA甲基化特征相比，慢性牙周炎患者的DNA甲基化特征可能存在差异[13]。

表观遗传修饰不是永久性的，可以通过改变环境来逆转[17]，因此通过牙周基础治疗（如刮治术）清除病原细菌可能会改变炎性区域的表观基因组。Viana等[18]采用甲基化特异性聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和DNA测序分析，分别对无牙周炎和慢性牙周炎患者的干扰素（interferon，IFN）-γ和IL-10的基因的DNA甲基化状态进行检验，结果表明牙周组织编码IFN-γ和IL-10的基因中存在甲基化。在类似的研究中，Stefani等[16]发现IL-6在慢性牙周炎患者牙龈组织中有较高表达水平，同时发现IL-6基因启动子区域存在部分甲基化。Zhang等[19]也发现牙周炎患者牙周组织中IFN-γ基因启动子区域内的低甲基化与IFN-γ基因转录表达的增加有关，并认为慢性牙周炎是一种不可逆转的牙周病，DNA甲基化可能是控制肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α表达的重要调控机制。DNA甲基化调控在慢性牙周炎发病中的作用及其机制尚不明确，需要进一步研究来证实。

3.2 DNA甲基化与口腔癌

大部分口腔癌属于发生于口腔黏膜的鳞状细胞癌。在口腔癌的的发生、发展过程中，口腔黏膜经历了异常增生、原位癌、浸润癌的不同病理阶段[20]。口腔癌高死亡率很大程度上归因于后期诊断。对疾病尤其是恶性疾病早期发现，预后较好[21]。

早期研究[22]表明，口腔癌癌变早期及晚期均存在异常甲基化。在基因组的重复序列中，低度甲基化很常见，而高度甲基化则被认为是导致口腔癌发展的主要因素[23]。在致癌物中，烟草及其代谢产物在口腔癌的发展中存在80%以上的风险，并通过改变DNA甲基转移酶的表达来促进基因的甲基化[24]。在癌变的早期阶段，微小RNA（microRNA，miRNA）表达改变在细胞转化过程中起关键作用[25]。

P16蛋白是抑制细胞周期G1期进展的调控因子，Cao等[26]通过甲基化特异性PCR技术检测出，在93例入组患者中，32例（41.0%）在口腔上皮异常增生病变中存在p16甲基化；在随访的78例患者中，22例（28.2%）口腔上皮异常增生病变中存在癌变组织。使用p16甲基化预测口腔上皮异常增生恶变的敏感性和特异性分别为63.6%和67.9%。Liu等[27]发现以p16甲基化阳性标准作为早期预测癌症发展的生物标志物时，灵敏度和特异性分别为62%和76%，进一步说明p16甲基化与口腔上皮异常增生的恶性转化相关，是预测轻度或中度口腔上皮异常增生的潜在生物标志物。由于样本含量以及研究设计的限制，仍需对口腔癌前期的表观基因组甲基化研究进行大量的纵向追踪。

近年来，对口腔鳞状细胞癌的全基因组甲基化的研究集中在识别异常的DNA甲基化，这些研究表明甲基化可能是参与口腔鳞状细胞癌发生、发展的重要机制，因此可以作为癌症医学诊断和预后的一个生物学标记物。然而，这些研究都是在特定地理位置的不同种族人群进行的，这些群体之间的表观遗传特征可能存在差异。因此，需要进行表观遗传学研究，以找出对口腔鳞状细胞癌有意义的、独特的DNA甲基化模式[22]。

3.3 DNA甲基化与口腔扁平苔藓

口腔扁平苔藓是一种常见的口腔黏膜慢性炎性疾病，病因和发病机制目前尚不明确[28]。

DNA甲基转移酶包括3种类型：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT3a与DNMT3b的功能是从头合成甲基化，在控制基因活性、胚胎发育和基因组印记方面起着重要作用；DNMT1是一种维持性酶，主要是维持甲基化，确保每个细胞的DNA甲基化模式正常复制，因此DNA甲基转移酶建立了一种新的甲基化模式[14]。

研究[29]表明，在口腔扁平苔藓中观察到DNA甲基转移酶（包括DNMT3b和DNMT1）的表达增加，DNMT3b的表达增加是由于DNA多态性。口腔扁平苔藓与正常黏膜相比，miR-137启动子区域呈现高度甲基化特征[25]。Cruz等[30]采用横断面研究方法分析了口腔扁平苔藓非糜烂病变组、糜烂病变组以及正常口腔黏膜（对照组）不同类型的DNA甲基化模式，结果发现仅在对照组（59.0%）中观察到STAT5A（信号传导及转录激活因子）基因的高度甲基化，与正常口腔黏膜相比，免疫应答相关基因的甲基化情况有所不同，需要进一步使用基因表达分析的研究来验证这些发现。

4 DNA甲基化与复发性阿弗他溃疡研究展望

复发性阿弗他溃疡是最常见的口腔黏膜溃疡类疾病，调查发现至少10%～25%的人群患有这种疾病[31]。这种疾病具有周期性、复发性、自限性特征；溃疡灼痛明显；好发于唇、颊、舌、软腭等无角化或角化较差的黏膜；根据临床表现可将其分为轻型、疱疹型（满天星样）、重型（弹坑样）；典型病灶具有“黄、红、凹、痛”的特征表象，即溃疡表面覆盖黄色假膜，周围有红晕带，中央凹陷，疼痛明显。轻者数月发作1次，重者慢性迁延，反复发作，妨碍饮食或说话，患者十分痛苦[32]。

复发性阿弗他溃疡的病因复杂，发病因素甚多，且尚未统一。但已有研究[33-34]证实，复发性阿弗他溃疡的发生与细胞免疫功能下降及T淋巴细胞亚群失调有关，其中辅助性T（T helper，Th）细胞起着重要的作用。Th1细胞主要产生IL-2和IFN-γ，参与调控细胞免疫；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10等，具有体液免疫的辅助功能[35]。Lewkowicz等[36]发现，在复发性阿弗他溃疡患者的细胞中存在一种典型的Th1型基因，Th1相关基因出现高水平表达；发现Th2细胞出现趋化因子C-C基序受体3的高水平表达。这些发现表明复发性阿弗他溃疡形成主要依赖于Th1型免疫反应的激活，患者Th1/Th2免疫失衡。

Bird等[37]的研究证实，在细胞因子以及转录因子调控Th1及Th2细胞分化的同时，伴随着DNA甲基化表观遗传的修饰，协同调控Th1及Th2细胞分化。有学者[38]指出，分化后的Th2细胞分泌的IL-4伴随着IL-4基因CpG岛的去甲基化；同时Th1细胞TNFG表达的增加伴随着IFN-γ基因的低度甲基化状态。

研究[13]已经证实，表观遗传调控与多基因复杂性状疾病的发病密切相关。复发性阿弗他溃疡的发生较为常见，是多基因综合作用的结果，且病情严重程度存在明显的个体差异。前面提到的炎症介质重要基因包括IL-4、TNFG等，其序列的变异可能会改变机体Th1/Th2细胞平衡以及炎症介质的调控，从而对复发性阿弗他溃疡的易感症和严重程度产生影响。因此，在DNA甲基化水平研究复发性阿弗他溃疡的发病机制，进一步用于疾病的预防及治疗具有非常重要的意义。

5 结语

综上，个体基因序列的差异可以影响个体对炎症的反应，而DNA甲基化的改变可以调控这种基因的表达，从而动态地调节个体对炎症的反应。在口腔疾病中，表观遗传修饰作用的证据正在增加。许多环境因素影响口腔组织的变化，但就其对退行性和炎症性疾病的影响方面的研究知之甚少。表观遗传修饰是可逆的，因此它可以作为治疗靶点。表观遗传治疗可应用于复杂性口腔炎症类疾病（如复发性口腔溃疡和口腔扁平苔藓），但在对口腔疾病的表观遗传治疗领域取得进展之前，还需要进一步的研究。