生物传感细胞ADP1_pWHlux表征水中污染物急性毒性的实验设计

张 凯, 陈 健, 贾建丽

(1. 中国矿业大学(北京) 化学与环境工程学院, 北京 100083;2. 中国矿业大学(北京) 地球科学预测绘工程学院, 北京 100083)

人类向环境排放的大量污染物长期在水环境中暴露和积累,其中不乏具有急性毒性的物质[1-4]。目前国际公认的对水中急性毒性的生物测定方法主要是通过藻类(大型藻)及淡水鱼(斑马鱼)两类标准生物法,但是操作过程复杂、漫长,难以广泛应用。近年来,通过基因工程改造而构建的生物传感细胞在检测水环境的急性毒性物质应用越来越引起研究人员的兴趣[5-6]。毒性物质通过阻碍细菌新陈代谢,进而抑制发光基因的表达,因此可通过细菌的发光强度测定水环境中急性毒性物质[7]。生物传感细胞检测水环境中急性毒性物质较传统方法具有响应速度快,操作步骤简单,灵敏度高,成本低等优点[8]。

当前,国内高校本科生环境监测、环境生物学等教学实验普遍是以污染物定量测定为主的经典国标法理化表征实验,实验内容比较陈旧,很难激发学生对实验课的兴趣,因此有必要设置一些学科前沿的实验课程[9-11]。利用发光菌毒性快速检测水体污染物的实验探索[12]，重金属Zn、Cu和Hg对重组发光细菌的影响[13],重组发光细菌应用于重金属检测技术研究[14]，BODIPY基荧光探针对铜离子检测[15]等实验虽然开展丰富了环境科学与环境工程学科的实验教学内容,但也存在一些如实验成本过高、实验步骤繁琐等不利于推广的问题。本实验采用的原料均廉价易得,实验用材料可自行培养获得,对实验条件要求不高,便于推广。因此,期望本实验的开展能够为环境科学与环境工程学科专业实验有所助益。

1 实验材料与设备

实验材料：急性毒性检测的生物传感细胞(ADP1_pWHlux)，HgCl2溶液，无菌去离子水。

主要设备：棕色瓶、移液器、酶标仪LB 962(Berthold,USA)与黑色底透96孔酶标板(Grenier,Germany)配合使用，计时器。

2 实验前准备

2.1 ADP1_pWHlux的培养

(1) 含200 μg/mL 氨苄青霉素的LBA(LBA_ amp200)固体培养基用于培养并保存ADP1_pWHlux菌株,平板培养皿保存温度4 °C,保存时间1个月,超过1个月要重新接种。使用时从平板培养皿中挑取ADP1_pWHlux单菌落接种到有5 mL LB_amp200的灭菌50 mL塑料离心管中,于30 °C、150 r/min的恒温振荡培养箱中过夜(16 h)培养,为保证传感细胞生长良好,测其OD600值须在0.4以上(如不符合要求,则重新接种培养),记为菌液A。菌液A保存于4 ℃冰箱,超过7 d时弃掉,重新从平板上接种培养。

(2) 取200 μL菌液A接种到约5 mL LB_amp200中,于30 ℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中过夜培养,测其OD600值,须在0.5～0.6(如不符合要求,则重新接种培养),记为菌液B。菌液B每次使用都需要重新接种。

(3) 将菌液B在6 000 r/min条件下离心10 min,收集菌体,弃上清,加入与离心前等量的LB重悬菌体(用移液器充分吹打重悬)。按照所设稀释比(此前实验验证1∶10为最佳稀释比)用LB培养基进行稀释,所得稀释后的ADP1_pWHlux菌液用于检测急性毒性。

2.2 污水水样的采集

选取靠近上清桥的清河的某排污口处、下游及上游3点各取500 mL的水样,分别记为A1、A2、A3,其中A2距排污口20 m,A3距排污口30 m,水样采集点距河岸5 m。

2.3 实验知识准备

实验课上,教师讲解在急性毒性物质作用下生物传感细胞的发光强度变化的原理,讲解酶标仪的原理(见图1)、基本构成以及使用方法(参照多功能读板机_BERTHOLD_LB9462操作流程),并完成实验设计的理论。

图1 酶标仪工作原理图

阅读参考文献[9-10],掌握发光细菌在测定水质综合毒性的研究进展、生物传感细胞的构建及其在急性毒性物质诱导下,基因表达方式及对发光强度的影响原理。生物传感细胞(ADP1_pWHlux)主要具有启动基因和报道基因相互耦合的结构,当启动基因为组成型表达时,毒性物质会抑制报道基因转录和翻译,通过检测报道产物的量的减少即可表征毒性的强度。利用生物传感细胞进行急性毒性测定主要是基于非特异型传感细胞应答机制,有毒物质通过阻碍细菌新陈代谢,抑制发光基因的表达,因此细菌发光强度与毒性物质浓度成负相关(Light-off效应)(见图 2)。

图2 非特异型生物传感细胞毒性检测应答机制

阅读文献[13],了解不同浓度的HgCl2及其他水环境中优先污染物(如 Be2+、Ba2+、Cu2+等)对 ADP1_pWHlux 发光强度的影响,初步掌握ADP1_pWHlux对水环境中急性毒性物质的检测。

3 实验

3.1 ADP1_pWHlux对HgCl2的响应

参照GB/T 15441—1995国家标准,本实验取HgCl2作为急性毒性检测的标准物质,分别稀释至质量浓度为0.4、1、2、3、4 mg/L,保存于30 mL棕色细口瓶中。分别在酶标板微孔内加入菌液100 μL ,取 100 μL 上述不同质量浓度 HgCl2加入酶标板各孔中,无菌去离子水作为阴性对照,共设置3个平行实验。酶标仪设置参数：每5 min读取每个酶标板微孔的化学发光强度值,共连续测定2 h。

根据每5 min测定的发光强度数值,绘制出ADP1_pWHlux在不同浓度HgCl2诱导下发光强度随时间的变化曲线。

3.2 ADP1_pWHlux对待测水样的测定

取100 μL待测水样和100 μL菌液混合,设置3个平行实验。在室温下,置于酶标仪中60min时测量其发光强度值。

计算出待测水样与 ADP1_pWHlux 混合 60 min 时的发光抑制率,并和标准的HgCl2溶液诱导下的发光抑制率相比较,快速表征水体的急性毒性程度。

3.3 数据处理

所有实验都设置3个平行组,分别计算平均值、标准偏差及发光抑制率。发光抑制率计算如下式：

发光抑制率=

上式反映待测水样中可被生物传感细胞有效利用部分的急性毒性水平。细胞对某种物质急性毒性的检出限定义为暴露于该质量浓度污染物60 min后,细胞发光明显低于阴性对照的质量浓度(P<0.05)[16]。发光抑制率越高,表明待测样品急性毒性越强,不具急性毒性的样品理论发光抑制率为0；在毒性水平相同条件下,发光抑制率越高,则说明传感细胞越灵敏。

4 实验结果

4.1 ADP1_pWHlux对HgCl2响应曲线绘制

ADP1_pWHlux分别在不同浓度的HgCl2诱导下,其发光强度随时间的变化见图3。由图3可知,当HgCl2的浓度高于0.4 mg/L时,ADP1_pWHlux的发光强度明显降低,其对急性毒性物质产生响应。4 mg/L 的HgCl2迅速对ADP1_pWHlux发光产生抑制,5 min时就可将发光强度降至初始的50%以下；诱导时间在100 min时,发光强度基本降至为0。大量实验结果表明,ADP1_pWHlux的发光强度在0.4～4.0 mg/L的HgCl2诱导60 min变化已较为明显,HgCl2浓度越高,其对ADP1_pWHlux的发光抑制越明显。为了简化检测水体急性毒性物质的步骤,快速得到结果,可直接读取诱导60 min时的发光强度值。

图3 不同浓度 HgCl2 对 ADP1_pWHlux 发光强度的影响

4.2 待测水样的急性毒性表征结果

ADP1_pWHlux 与待测水样混合至60 min 时读取发光强度值,并计算出发光抑制率,并与在0.4～2.0 mg/L的HgCl2诱导下ADP1_pWHlux的发光抑制率相比较,结果如图4所示。由图可知,在清河所取的3个水样的急性毒性大小顺序：0.4 mg/L HgCl2急性毒性

图4 ADP1_pWHlux对污染水样的检测(诱导60min)

5 结语

生物传感细胞ADP1_pWHlux表征污水急性毒性在环境检测、污染物毒性评估等诸多领域获得了高度的关注与应用,研究进展突飞猛进。通过本实验,不仅可以锻炼学生的基本实验操作技能,还可以加深学生对环境生物检测前沿技术的理解,激发学生的专业兴趣和对科学的探索与研究。本实验应用在我校环境科学与工程专业本科生专业实验课程中取得了良好的教学效果,因此建议在环境领域相关学科中广泛推广。