高效氯氰菊酯暴露对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响

周永江 方方 李超 高明妃 郭泽莉

摘要：目的  探討高效氯氰菊酯暴露对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响。方法  将SPF级断奶昆明雌鼠40只随机分为对照组和实验组，每组20只，以灌胃方式染毒90 d。对照组给予玉米油灌胃;实验组给予10 mg/（kg·bw·d）β-CP+玉米油灌胃。染毒结束后，随机抽取对照组和实验组各10只发情期雌鼠分别与雄鼠合拢，次日清晨见阴栓记为孕1 d（D1），于D8 d处死小鼠。各组剩余雌鼠与输精管结扎的雄鼠合笼建立假孕模型，于假孕第4天（PD4）小鼠宫角注射玉米油。D8和PD8 d摘取小鼠子宫，观察胚胎着床情况和蜕膜化诱导情况及镜下观察子宫内膜厚度。采用RT-PCR和ELISA法分别检测检测蜕膜化标志分子dtPRP和BMP2的表达。结果  β-CP暴露降低了小鼠蜕膜化诱导成功率，降低了子宫内膜厚度及dtPRP和BMP2的表达（P<0.05）。与对照组的人工诱导蜕膜化成功率（100.00%）相比，实验组小鼠的人工诱导蜕膜化成功率（30%）下降，差异有统计学意义（？字2=10.77，P<0.05）。结论  β-CP暴露通过抑制dtPRP和BMP2的表达影响小鼠子宫内膜的蜕膜化，降低了子宫内膜厚度，影响了胚胎着床。

关键词：高效氯氰菊酯;子宫内膜蜕膜化;小鼠

中图分类号：R114;R711.6;                              文献标识码：A                          DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.03.020

文章编号：1006-1959（2019）03-0061-04

Abstract：Objective  To study the effect of beta-cypermethrin on deciduation of endometrium in female mice. Methods  40 female Kunming mice of SPF grade weaning were randomly divided into two groups： control group and contamintated group with 20 each，and were contamintated by the way of lavage for 90 d.The control group was lavaged with corn oil.The contamintated group was lavaged with 10mg/（kg·bw·d）β-CP+corn oil.At the end of contamination， 10 female mice in the control group and 10 mice in the contamintated group were randomly selected to put in a same cage with the male mouse respectively. Early the next morning，Yin suppository was recorded as the first day of pregnancy（D1），and the mice were killed on D8 d.The model of pseudopregnancy was established by putting the remaining female mice in each group and male mice ligated by vasectomy in a same cage.Corn oil was injected into the uterine horn of mice on the 4th day of pseudopregnition（PD4）.The embryo implantation， decidualization induction and endometrial thickness were observed by D8 and PD8 d.The expression of dtPRP and BMP2 were detected by RT-PCR and ELISA，respectively.Results β-CP contamination decreased the success rate of decidualization induction， the thickness of endometrium and the expression of dtPRP and BMP2 in mouse decidua （P<0.05）.Compared with the control group， the success rate of artificial induced deciduation （100.00%） in the experimental group decreased （30%）， and the difference was statistically significant （？字2=10.77， P<0.05）.Conclusion  β-CP contamination affects decidualization of mice endometrium by inhibiting the expression of dtPRP and BMP2，decreases the thickness of endometrium and affects embryo implantation.

Key words：Beta-cypermethrin;Endometrial decidua;Mice

高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin，β-CP）作为一种高效、广谱、速效的杀虫剂，被广泛使用[1]。β-CP是从普通氯氰菊酯（cypermethrin，CP）经差向异构得到两对活性较高的对映体，即顺式氯氰菊酯（α-CP）和反式氯氰菊酯（β-CP），β-CP活性比CP高1倍，且对光稳定[2]。因此，其残留对人体健康的潜在危害不容忽视。β-CP主要用于防治果蔬、茶叶、谷物等作物上的食叶或食果害虫[3]，因其高残留性使得β-CP在水、土壤中均有残留，在许多食材中也检测出其残留，如甘蓝、青菜、叶用莴苣、芹菜、韭菜、通心菜等[4，5]。最近的一项调查指出在定西地区市售蔬菜拟除虫菊酯类农药总检出率为45.0%，超标农药主要为氯氰菊酯和β-CP[5]。β-CP具有神经毒性，动物实验表明可能通过降低多巴胺神经递质的含量，导致神经毒性[6]。人体接触中毒后可出现头疼、头晕、胸闷、恶心，烦躁、胡言乱语、四肢无力等症状[7]。动物实验显示，β-CP可破坏雄性小鼠的生精小管并且影响精子的发生，进而造成睾丸组织中精母细胞、支持细胞、间质细胞数量减少，精子畸形[8]。当β-CP作用于雄性大鼠后，体重、显著降低，睾丸和精囊显著增大[9]，血清和睾丸中的睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素水平发生显著变化[10]。有研究发现，雌性小鼠孕期接触β-CP可使雌性小鼠妊娠时间延长，随着β-CP剂量的增加，小鼠分娩率和平均产仔数均有下降趋势[11]。处于染毒早期的大鼠受孕率和胚胎着床数减少，死胎增多。β-CP暴露是否会影响子宫内膜蜕膜化了，目前还未见报道。本课题组前期研究发现，β-CP暴露降低了胚胎植入率，使雌鼠的血清雌二醇水平上升、孕酮、卵泡刺激素和黄体生成素的血清水平下降，卵巢结构发生改变，各级卵泡数量随染毒浓度的增加而减少[12，13]，但未能揭示β-CP暴露是否会对小鼠子宫内膜蜕膜化产生影响。因此，本实验是在此研究基础上，通过建立雌性小鼠 β-CP染毒模型对孕期蜕膜化分子标志物dtPRP、子宫内膜厚度的观察测量以及BMP2的检测，探索β-CP对子宫内膜蜕膜化建立的影响，为更深入研究其雌性生殖毒性提供实验依据和理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物  SPF级断奶昆明雌鼠，购买于长沙天勤生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（湘）2014-0011。饲养于海南医学院科学实验中心动物房内。动物饲料及垫料购买于长沙天勤生物技术有限公司。所有动物实验均得到海南医学院伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂  β-CP（山东西亚化学工业有限公司，Cas号：65731-84-2）;细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）;Primers[生工生物工程（上海）股份有限公司];PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit[宝生物工程（大连）有限公司]。

1.2构建β-CP染毒模型  SPF级断奶昆明雌鼠40只，体重10～15 g， 3周龄，随机分为对照组和实验组，每组20只。小鼠进行适应性喂养7 d后，于每天早上9点以灌胃方式染毒，染毒时间设定为90 d;实验组：灌胃10 mg/（Kg·bw·d）β-CP+玉米油。对照组：灌胃等量玉米油;染毒期间自由进食与饮水，每2 d更換垫料，清洗盒子并对其消毒，称量体重，记录摄食量。染毒结束后先对各组小鼠体重称量并记录。染毒后进行后续实验操作。

各组小鼠灌胃溶质和溶剂计算方法：每周1次称量各组小鼠体重，计算各组小鼠的平均体重值M（g）。依据上述各染毒组浓度结合各组小鼠平均体重计算出各染毒组灌胃溶质量;结合各组小鼠平均体重（g），依灌胃容量为0.01 ml/g计算各组灌胃体积，即溶剂玉米油体积。

1.3建立小鼠体内人工诱导蜕膜化模型  小鼠子宫内膜自然蜕膜化模型：染毒结束后随机选取对照组和实验组各10只雌鼠分别与性成熟雄鼠按3∶1合笼交配，次日清晨见阴栓记为孕第1天（D1），于D8天上午颈椎脱臼法处死小鼠，摘取小鼠子宫，计数小鼠胚泡。小鼠子宫内膜人工诱导蜕膜化模型：染毒结束后随机选取对照组和实验组各10只发情期的雌鼠与输精管结扎的雄鼠也按3∶1合笼交配，次日为假孕第1天（PD1）。PD4小鼠清晨双侧宫角注射玉米油各25 μL，至PD8上午取材。

1.4实时定量PCR检测dtPRP在小鼠子宫基质细胞中的mRNA表达水平  刮取D8和PD8雌鼠子宫内膜组织：摘取小鼠子宫，剔净脂肪和系膜组织，沿子宫纵轴切开子宫，机械刮取内膜组织，PBS清洗3次备用提取RNA检查dtPRP的mRNA表达水平。提取RNA，反转录合成DNA，之后Real-time PCR 法进行定量测定RNA。引物序列为Dtprp：Forward：5'-AGCCAGAAATCACTGCCACT-3';Rerverse：5'-TGA TCCATGCACCCATAAAA-3';β-actin：Forward：5'-GTGGGGCCCCAGGCACCA-3'; 5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。

1.5 ELISA检测BMP2在小鼠子宫基质细胞中的表达  取部分小鼠子宫内膜组织于匀浆器中加入胰蛋白酶进行消化，同时进行机械匀浆、分离，收集上清液，采用ELISA法检测BMP2。测试步骤严格按照试剂盒提供的参考方法进行。

1.6统计分析  实验数据采用Excel整理，SPSS 22.0软件进行统计学分析，所有统计图采用Graph Pad Prism 5.0软件绘制。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用两独立样本的t检验，计数资料以（%）表示，采用？字2检验， P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组小鼠一般情况比较  染毒期间各组小鼠均无死亡且饮食、行为活动等无异常。染毒后，实验组小鼠体重低于对照组，差异有统计学意义（t=3.102，P=0.006）。

2.2 β-CP暴露对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响  对照组成功诱导10例，实验组成功诱导3例，与对照组的人工诱导蜕膜化成功率（100.00%）相比，实验组小鼠的人工诱导蜕膜化成功率（30.00%）下降，差异有统计学意义（？字2=10.77，P<0.05）。

2.3 β-CP暴露对小鼠子宫内膜厚度的影响 在小鼠子宫内膜自然蜕膜化过程中，实验组小鼠子宫内膜厚度与对照组相比显著变薄，且差异有统计学意义（t=9.595，P<0.05）。在人工诱导小鼠子宫内膜蜕膜化过程中，实验组小鼠子宫内膜厚度与对照组相比显著变薄，且差异有统计学意义（t=6.544，P<0.05）。人工诱导蜕膜化的实验组小鼠子宫内膜厚度与自然蜕膜化的实验组小鼠相比，内膜厚度有所增厚，但差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 β-CP暴露对dtPRP在子宫内膜基质细胞中表达的影响  染毒后，实验组dtPRP在子宫内膜基质细胞中表达与对照组相比发生了显著变化，差异有统计学意义（t=30.762，P<0.05），在自然诱导小鼠子宫内膜蜕膜化过程中，实验组dtPRP在子宫内膜基质细胞中表达与对照组相比，显著下调且差异有统计学意义（P<0.05）。染毒后，实验组dtPRP在子宫内膜基质细胞中的表达与对照组相比发生了显著变化，差异有统计学意义（t=6.544，P<0.05），在人工诱导小鼠子宫内膜蜕膜化过程中，实验组dtPRP在子宫内膜基质细胞中表达与对照组相比，显著下调且差异有统计学意义（P<0.05）。

2.5 β-CP暴露对BMP2在小鼠子宫内膜基质细胞中表达的影响  在自然诱导小鼠子宫内膜蜕膜化过程中，BMP2在实验组小鼠子宫内膜基质细胞中表达与对照组相比，表达显著下调且差异有统计学意义（t=16.133，P<0.05）。在人工诱导小鼠子宫内膜蜕膜化过程中，BMP2在实验组小鼠子宫内膜基质细胞中表达与对照组相比，表达显著降低且差异有统计学意义（t=14.111，P<0.05）。

2.6 β-CP暴露对小鼠胚胎着床的影响  与对照组相比，实验组胚胎着床数减少，但结果未见统计学差异（P=0.089）。

3討论

子宫内膜蜕膜化是子宫内膜的一种特殊分化过程，与妊娠有着密切联系。蜕膜化包括子宫腺的内分泌改变、基质细胞的分化、子宫自然杀伤细胞的积聚和血管再生。蜕膜化的子宫内膜间质细胞（endometrial stromal cells，ESCs），在细胞形态和功能上都发生明显变化，细胞的形态由梭形逐渐变为多角形，胞体大而圆，胞质丰富，细胞间的界线不清[14]，人类子宫内容蜕膜化受多种激素的调节，孕酮诱导子宫内膜基质细胞分化为蜕膜细胞[15]。本研究采用小鼠妊娠D8处死小鼠，获取子宫组织，这种方法获得的子宫组织是已经产生蜕膜化的组织，即无需人工激素处理。本实验结果表明，β-CP暴露小鼠蜕膜化诱导成功率显著下降，子宫内膜厚度显著变薄。可能的原因是β-CP影响了dtPRP和BPM2在小鼠子宫内膜基质细胞中的表达，对表达起到了抑制作用。

既往研究报道可采用如注射芝麻油、玻璃珠及子宫划伤等人工诱导的方法模拟蜕膜化过程，同时检测标志分子，比如dtPRP、PR、Cyclin D3、PRL、ALP（碱性磷酸酶）等来判断诱导是否成功[16]。分泌催乳素即（dtPRP），被广泛认为是ESCs蜕膜化的标志[17]。本研究中，采用了检测dtPRP 和BMP2在蜕膜化组织的表达。β-CP暴露后，dtPRP在小鼠子宫内膜蜕膜细胞中的表达随着β-CP暴露染毒剂量的增加而下调。BMP2是BMP/Smads通路的相关基因，是调控成骨的重要通路之一[18]。文献指出，BMP2能促进人ESCs蜕膜化，当BMP2的表达受到抑制时，将造成不孕和妊娠损失[19]。本实验中发现，当β-CP下调BMP2在子宫内膜间质细胞的表达时，蜕膜化诱导成功率降低显著，子宫内膜厚度也显著变薄。β-CP可能直接或间接的抑制了BMP2在蜕膜组织中的表达。

综上所述，β-CP暴露显著降低了dtPRP和BMP2表达，降低了子宫内膜厚度，减少了胚胎着床率。β-CP对雌鼠子宫内膜的蜕膜化进程有干扰作用，但确切的影响机制还有待进一步的实验研究。

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收稿日期：2018-12-16;修回日期：2018-12-25

编辑/肖婷婷