丝素蛋白支架修复骨软骨损伤研究进展

柳昌全 王进 赵广雷 石晶晟 陈杰 黄钢勇 陈飞雁 魏亦兵 王思群 夏军

骨软骨损伤在临床骨科较为常见，该损伤同时累及上方的关节软骨和下方的软骨下骨，其自身修复能力差[1-2]。目前，骨软骨损伤主要采用手术治疗，相应方法均取得一定的修复效果，但仍存在不足[3]。近年来，组织工程技术在骨软骨损伤修复中得到广泛应用，丝素蛋白为热点材料之一。丝素蛋白具有良好的生物相容性、可控的降解速率(持续数小时至数年)以及卓越的机械性能，且与人体骨的有机成分类似[4-5]。目前应用于组织工程的丝素蛋白常有以下几种形式：丝素蛋白薄膜、电纺和湿纺丝素蛋白纤维、丝素蛋白凝胶、3D多孔丝素蛋白支架、丝素蛋白微粒等[6]。其中支架形式的丝素蛋白在应用时常会与其他材料、生物因子混合，有时还会借助生物反应器装置，以提高相应支架的机械性能、生物相容性和降解性能等。

1 与骨软骨修复相关的丝素蛋白支架

从组织工程角度看，想重建组织功能，首先需重建组织的正常结构。因此，在骨软骨修复中，出现了单相、双相和三相支架这类能更好模拟骨软骨结构的支架。单相支架由1种材料或1种无空间变化的复合材料制成。从细胞或生物学的角度来看，单相支架在整个支架结构中仅有1个细胞类型，而且没有相应生物活性分子的变化分布；与之对应的，双相和三相支架使用2～3种材料或复合材料来构建相应的多层结构，在不同支架层中播种不同类型的细胞，或加入生物活性分子于不同支架层来创建多个生物环境[7]。应用于骨软骨修复的丝素蛋白支架亦可用上述分类法。

1.1 丝素蛋白单相支架

丝素蛋白单相支架常采用丝素蛋白或复合其它材料的丝素蛋白制成，复合材料中通常包括：天然聚合物，如胶原蛋白、明胶、糖胺聚糖、壳聚糖、淀粉、透明质酸、藻酸盐、细菌来源的聚合物(羟基链烷酸酯)；无机物，如羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃；合成聚合物，如聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯和聚乙二醇[8]。由丝素蛋白或复合其它材料的丝素蛋白制成的支架常具有良好的降解率以及不同的强度和孔隙率，能够较好模拟周围组织的特性，从而促进与宿主组织的充分整合。

一些实验结果也表明，此类单相支架可为软骨细胞或骨细胞的黏附和扩增提供良好支持。Augst等[9]将种植了人间充质干细胞(hMSC)的丝素蛋白单相支架分别置于成骨组、成软骨组、对照组的培养基中培养3周，然后将成骨组和成软骨组的支架融合成复合材料，再分别置于成骨组、成软骨组、对照组的培养基中培养3周。实验结果显示，在复合培养过程中(3～6周)，软骨组织和骨组织在3种培养基中均有形成，但骨样组织形成优于软骨组织。Kazemnejad等[10]用再生丝素蛋白/天然丝素蛋白制作单相支架，实验中他们将支架与兔自体软骨细胞复合，然后植入小鼠皮下，发现带自体软骨细胞的支架较不带细胞的支架有更强的修复能力；在支架植入36周后发现，带自体软骨细胞支架修复部位，大部分显示出再生的透明样软骨。但单相支架也有缺点，如缺乏再生骨软骨组织的内在物理结构等[11-12]。

1.2 丝素蛋白双相支架

由丝素蛋白构建的双相支架常具有刚性的软骨下骨层，该层用以支撑覆盖的软骨并与天然骨骼结合，而支架的软骨层则用于种植和扩增软骨细胞或间充质干细胞以及软骨细胞外基质的后续沉积。支架的软骨层常由单独的丝素蛋白或丝素蛋白与天然糖类的聚合物(如糖胺聚糖、壳聚糖、淀粉、透明质酸和藻酸盐等)混合制成[13]，软骨下骨层常由丝素蛋白和无机物(如羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃等)混合制成[11]。通过此方法合成的软骨层及软骨下层能够在生化、物理性能方面更好地模拟真实组织，从而在骨软骨修复方面有更好的应用前景。Chen等[14]制作了丝素蛋白-RADA肽链(软骨相)/丝素蛋白-RADA肽链(软骨下骨相)双相支架，软骨相和软骨下骨相同时种植兔间充质干细胞。实验中将软骨相置于成软骨性培养液中，软骨下骨相置于成骨性培养液中进行培养，通过基因表达检测、组织学和生化分析等发现，在成软骨性培养液中的支架形成了类似软骨的结构，成骨性培养液中的支架形成了类似软骨下骨的结构，两者交界处则发现了类似软骨结构中钙化层的结构。Zhang等[15]制作了胶原蛋白(软骨相)/丝素蛋白-羟基磷灰石(软骨下骨相)双相支架并在支架上种植兔骨髓间充质干细胞(rBMSC)。在动物体内实验中，他们发现，植入该双相支架结合关节腔内注射甲状旁腺激素4～6周，能够有效抑制细胞的终末分化，促进软骨形成，改善软骨的修复和再生。然而双相支架也存在一定的缺陷，如在机械强度上达不到真实组织的程度，软骨层与软骨下骨层结合不牢固，支架破坏下沉，软骨相纤维软骨形成等[16]。

1.3 丝素蛋白三相支架

三相支架中比双相支架多出的界面层常使用丝素蛋白和无机物(如羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃等)混合制成，其较双相支架更好地模拟了骨软骨的结构层次。Ding等[17]制作了丝素蛋白(软骨相)/丝素蛋白-羟基磷灰石(中间相)/丝素蛋白-羟基磷灰石(软骨下骨相)三相支架。细胞实验表明，该支架具有很好的生物相容性，能够支持脂肪干细胞(ADSC)的生长、增殖和浸润。组织学和免疫组织化学染色、实时PCR检测证实，在体外成软骨或成骨诱导培养基的作用下，ADSC能够分别在软骨相和软骨下骨相向软骨细胞和成骨细胞分化，而中间相能够起分离作用，即阻止软骨相和软骨下骨相的细胞混合。Çakmak等[18]制作了两性蛋白凝胶(软骨相)/4%丝素蛋白(中间相)/6%丝素蛋白+5%羟基磷灰石(软骨下骨相)三相支架，其中软骨相种植人羊膜细胞(hAC)，软骨下骨相种植人骨髓间充质干细胞。实验中他们发现，当软骨相和软骨下骨相分别在成软骨性、成骨性培养基内培养时，相应细胞表现出良好的生存能力和增殖性。当该三相支架在共培养基内培养时，碱性磷酸酶、成骨标记物、钙含量检测和组织学染色的检测结果表明，在该共培养体系中hAC的存在极大地促进了人骨髓间充质干细胞的成骨性分化，而且hAC能够在缺乏转化生长因子(TGF)-β家族的条件下依然在相应的软骨区域产生大量糖胺聚糖。但是，目前三相支架界面层的制作工艺仍有一定缺陷，这是急需解决的问题[7]。

2 丝素蛋白支架的组织工程要素

骨软骨组织工程的发展趋势是利用多相支架模拟天然的骨软骨组织的多相性。多相丝素蛋白支架的应用常涉及多种材料、细胞以及生长因子，此外，近年来生物反应器在组织工程中的作用越发明显。

2.1 细胞

在用丝素蛋白支架进行骨软骨修复时，通常在支架部位种植相应细胞，如成骨细胞、软骨细胞和间充质干细胞(MSC)。使用软骨细胞在很多方面存在困难，比如细胞难以分离[19]，容易在培养和扩张过程中失去表型等[20]，因此，骨软骨修复时常使用成骨细胞或MSC，其中又以后者居多，主要利用其良好的增殖特性及多相分化潜能[21]。

在使用丝素蛋白双相或多相支架时，学者们常将MSC分别与支架的软骨相及软骨下骨相结合，先在体外的成骨性或成软骨性培养基中培养后种植于实验动物的骨软骨缺损处，或不经培养直接种植于缺损处。相关实验结果已表明，此类支架修复效果良好。Li等[22]制作丝素蛋白(软骨相)/丝素蛋白-SHG生物活性陶瓷(软骨下骨相)双相支架，该支架的软骨相和软骨下骨相有不同的孔隙率，能够很好地模拟真实组织的孔隙情况。该支架上种有hMSC，体外细胞实验发现，该支架的软骨相和软骨下骨相中的hMSC能够分别向成软骨性和成骨性细胞分化。Yan等[23]制作丝素蛋白(软骨相)/丝素蛋白-纳米级磷酸钙(软骨下骨相)双相支架用于修复骨软骨缺损。在细胞实验中发现，rBMSC在该支架上有很好的黏附及增殖特性；相关实验结果也表明rBMSC在这类支架中能够分别进行成骨性和成软骨性分化，提示该种支架有望应用于骨软骨修复。Ruan等[24]制作丝素蛋白-壳聚糖(软骨相)/丝素蛋白-壳聚糖-羟基磷灰石(软骨下骨相)3D双相支架，他们发现，BMSC能够很好地在该支架上增殖、生长，并且在动物实验中发现，通过该支架的软骨相和软骨下骨相BMSC的成软骨性和成骨性增殖分化，能够在一定程度上修复骨软骨缺损。

2.2 生长因子

虽然已有大量实验证据表明，丝素蛋白能够在一定程度上促进骨和软骨形成，但促进程度有限。因此，常需要在丝素蛋白支架上添加一定的生长因子，常用者为骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-7、TGF-β、胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ及其组合，应用时它们常被制备成溶液或被包裹于微球内。生长因子在体内、体外对骨软骨形成起重要作用，一些因子已被验证在特定浓度下能够促进骨软骨形成[3]，但如果没有被正确应用，有时也可能产生不良后果[25]。目前常用因子中，BMP-2、TGF-β能够促进软骨形成[25-26]、重组人胰岛素样生长因子(rhIGF)-Ⅰ能够促进重组人骨形态发生蛋白(rhBMP)-2相应的促成骨、成软骨能力等[27]。

Vunjak-Novakovic等[28]早在2005年就提出，可使用生长因子梯度性变化构建相应的丝素蛋白双相支架。他们制作了一类丝素蛋白支架，并且共价结合IGF-Ⅰ(促软骨生成)和BMP-2(促骨生成)2类因子，这2类因子的浓度在支架上呈现反向的趋势，分别从支架一端到另一端递增，BMP-2浓度高的一端具有成骨性，IGF-Ⅰ浓度高的一端具有成软骨性，然后利用该支架进行相应实验。在该文献中，作者并未展示实验结果，但提出的该类“同时进行骨软骨修复”支架的新观念，为后续研究提供了新的思路。

在聚合物支架中，对生长因子传递时间和空间的控制至关重要。Wang等[29]制作一种多孔的双相丝素蛋白支架，分别将rhBMP-2丝素蛋白微球、rhIGF-Ⅰ丝素蛋白微球和rhBMP-2/rhIGF-Ⅰ丝素蛋白微球与之融合，然后将hMSC种植于3类支架上，并在具有成骨性和成软骨性的培养基中培养。5周后，hMSC在与rhBMP-2丝素蛋白微球、rhBMP-2/rhIGF-Ⅰ丝素蛋白微球融合的支架上展现出成骨性和成软骨性分化，这提示丝素蛋白微球传递rhBMP-2优于传递rhIGF-Ⅰ。这种新颖的丝素蛋白微球/支架系统为多种生长因子的传递提供了新选择，通过对其三维培养环境的空间控制，研究者可进一步理解自然组织生长过程，还能在体外进行复杂的组织工程研究。

Saha等[30]分别用2种原材料(家蚕蚕丝、印度柞蚕蚕丝)制作单相丝素蛋白支架，在体内实验中他们发现，复合了TGF-β3或BMP-2的无细胞丝素蛋白支架上有新生的骨软骨组织生长，且新生组织与原有组织能很好地融合。这项研究提出了“用不同原材料的丝素蛋白支架组合修复骨软骨缺损”的设想，同时也验证了TGF-β3、BMP-2具有促进骨软骨组织生长的能力。

2.3 生物反应器

仅靠丝素蛋白支架、生长因子和细胞的完美结合还不能够成功再生骨软骨结构，为了维持分化细胞的表型并促进其结构成熟，需要生物反应器进行环境控制。生物反应器能够充分复制体内的生物环境，在支架内为相应的种子细胞提供营养支持，促进细胞与周围环境的物质传递，提供相应的物理和化学信号刺激，有助于骨软骨组织再生[31]。组织工程骨软骨组织生物反应器原则上至少包含2个分区：软骨部分和骨部分(包括中间的接合部)，这有利于在相应区域为细胞提供用于形成特定组织结构的环境传导和刺激因素(包括提供特定培养基)。在软骨相，提供软骨生长因子结合动态负荷；在骨相，提供成骨生长因子结合间隙流动的介质来促进养分转移及提供所需的剪切应力。在这种仿生生物反应器中，软骨相和骨相各部分都受到足够刺激，同时生长，从而达到“形成类似于原生骨软骨结构的骨软骨组织”的目的[10]。

应用生物反应器使得“以rBMSC作为单细胞来源进行多层骨软骨构建”的单步方法具备可行性，且在构建相应骨软骨组织时可以不预先将支架与细胞共混培养。Chen等[32]采用独特的两室共培养方式培养带有rBMSC的丝素蛋白-RADA肽链支架，2个间室分别含有成骨性和成软骨性培养液；实验结果显示，成骨性培养液中支架形成了类似软骨下骨的结构，成软骨性培养液中支架形成了类似软骨的结构，交界处支架出现了类似于软骨结构中钙化层的结构。

3 结语

已有越来越多的研究者将丝素蛋白支架运用于骨软骨修复的研究。从单相丝素蛋白支架到多相丝素蛋白支架，从单纯丝素蛋白支架到载有细胞、生长因子的丝素蛋白支架，支架结构越来越接近骨软骨结构，相关实验的效果也越来越好。然而，应用丝素蛋白支架进行骨软骨损伤修复还存在着很多问题。例如，在双相和多相支架中如何优化软骨层和软骨下骨层之间界面层的构建以及不同相之间的连接；如何解决支架在植入动物体内后容易出现塌陷的问题；在双相、多相支架中如何准确诱导不同相中的干细胞分别向相应的骨细胞、软骨细胞分化；如何避免在支架植入后纤维软骨形成等。随着材料学和现代医学的进步，丝素蛋白及其复合材料在骨软骨损伤修复的应用范围和前景会更加广阔。