基于RSM模型的碱性磷酸酶参考方法测量条件研究

刘春龙 钱 全 王 勇 李申龙 徐元勇△

近年来国际检验医学溯源联合委员会(JCTLM)和卫计委临床检验中心一直致力于检验医学的标准化研究,希望能够实现不同医院检验结果的互认和统一[1]。但酶的测定结果往往非常混乱,同一标本在不同实验室的数据结果 相差很大[2]。国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)在1986年完成了碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的推荐参考方法[3]。由于酶学参考测量存在诸多的影响因子,ALP参考方法的测量条件需要由参考实验室在不违背参考方法既定要求的前提下进行优化。考虑响应面法(response surface methodology,RSM)不仅考虑各种影响因子对测量曲线的线性影响,也同时考虑不同因子间的交互影响和曲率影响[4]。本文基于RSM模型研究ALP参考方法的测量条件,现报道如下。

材料与方法

1.实验材料

(1)样本

收集北京航天总医院检验科血清样本,考虑溶血、黄疸、乳糜样本会影响正确度验证结果[5],本研究通过检验报告结果及肉眼观察,剔除溶血、黄疸、乳糜的样本,根据常规检验结果将血清进行混合,制备成符合所需浓度范围要求的混合血清。以3000r/min的转速离心处理,用0.2μm滤膜过滤后,分装冻存于-80℃低温冰箱。

ALP参考物质选用日本临床实验室标准委员会的CRM-001c(靶值为425U/L,扩展不确定度为3.06%,k=2)。

(2)主要仪器

Cary-100紫外、可见分光光度计(美国安捷伦公司)、XSE205十万分位电子天平(瑞士梅特勒-托利多国际股份有限公司)、MICROLAB500稀释配液仪(瑞士哈密尔顿公司)、HH-4恒温水浴箱(中国国华电器有限公司)、F1523手持式铂电阻温度计(美国福禄克电子仪器仪表公司)。

(3)主要试剂

N-β-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA,批号MKBD2551)、七水硫酸锌(批号62150)、醋酸镁(批号40680),购自美国西格玛公司;2-氨基-2甲基-1-丙醇(AMP,批号130517A)、磷酸对硝基苯酚(4-NPP,批号130708A),购自中国阿匹斯公司。

2.方法

(1)单因素实验

结合ALP项目参考测量原理,初步确定影响因子[6]。绘制不同影响因子与酶催化活性浓度测量结果的趋势关系图,确定各影响因子是否为重要影响因子,并观察趋势图是否包含最高值[7],以判断是否能确定RSM实验区域。

(2)RSM实验

按单因素实验结果,确定三个重要影响因子及实验区域,实验区域包括高、中、低三个浓度水平(三因子三水平)。采用Box-Behnken实验设计并按设计方案配制试剂,测量相同混合血清样本;绘制不同影响因子与测量结果的等值线图和响应曲面图。

(3)验证实验

测量ALP参考物质CRM-001c,若测量结果符合其测量不确定度要求,则验证通过。

(4)统计分析方法

①单因素实验采用Minitab 16软件进行单因素方差分析,判断影响因子对ALP催化活性浓度的影响在不同浓度组间是否具有统计学意义。②RSM实验采用Minitab16软件先分别进行RSM图形分析(等值线图与曲面图)、RSM模型显著性分析、RSM模型方差分析、测量结果回归系数估计,建立模型方程式后再使用优化器功能确定最佳测量条件。③计算正确度验证实验测量结果与参考物质靶值的相对偏移,再判断其是否符合参考物质的测量不确定度要求。

结 果

1.单因素实验结果

影响因子不同水平设计,见表1。

2.单因素分析

进行单因素方差分析,结果表明反应液pH值、4-NPP浓度、AMP浓度三个因子对ALP酶催化活性浓度的影响在不同组间具有统计学意义(P=1.14×10-9<0.01),因此所选定的三个影响因子均为重要影响因子。绘制趋势图(图1),可见单因素实验所确定实验区域可包括ALP最高催化活性。因此可将水平3设置为RSM设计中心点[8]。

表1 影响因子不同水平设计

图1 影响因子与其催化活性浓度结果的趋势图

3.RSM实验结果

(1)Box-Behnken设计及催化活性浓度测量结果,见表2。

表2 Box-Behnken设计测量结果

(2)ALP项目RSM图形分析,见图2～图4。

从图形可以看出,ALP测量结果与各影响因子间都存在响应曲面,4-NPP浓度和AMP浓度与测量结果的等值线图轴线与坐标轴存在明显的角度,说明4-NPP浓度和AMP浓度之间存在明显的交互作用,其他影响因子之间不存在交互作用。另外,pH值均处于等值线椭圆形的短径处,即测量结果的变化对pH值最为敏感。在ALP试剂配制时,应严格控制反应液pH值。

(3)RSM模型方差分析,见表3。结果显示所有重要影响因子对测量结果的影响有统计学意义(P<0.01),模型拟合效果良好(失拟项P>0.05),模型R2=94.36%和调整R2=95.99%,表明模型拟合效果良好。

表3 RSM模型方差分析

(4)测量结果回归系数估计,见表4。

分别用Y表示ALP测量结果,A表示反应液pH值,B表示4-NPP浓度,C表示AMP浓度。

ALP各影响因子的一次效应和二次效应对ALP测量结果均存在显著影响(P<0.01),4-NPP浓度和AMP浓度之间存在显著交互作用(P<0.05),其他影响因子之间不存在明显交互作用(P>0.05)。

图2 ALP测量结果与4-NPP浓度,pH值的等值线图和曲面图

图3 ALP测量结果与AMP浓度,pH值的等值线图和曲面图

图4 ALP测量结果与AMP浓度,4-NPP浓度的等值线图和曲面图

表4 测量结果的回归系数估计

(5)测量条件优化

使用Minitab 16软件中的RSM模型优化器功能,选择“望大”分析,即选择混合血清测值最高时的测量条件。预测结果复合合意性均大于0.99,预测结果见图5,[]内数字表示预测最佳测量条件,即ALP理论最佳测量条件为反应液pH值10.24、4-NPP浓度15.83mmol/L、AMP浓度747.28mmol/L。

(6)正确度验证结果见表5。

表5 正确度验证结果

讨 论

检验医学的标准化和一致化研究,是检验医学领域的热门话题,国内于2012年已初步建立了国家酶学参考实验室网络[9]。目前市场上ALP项目的测量结果与参考方法测量结果相对偏移可达8%～10%[10]。在ALP参考方法运行的过程中,必须对测量条件进行摸索和优化,以期找到最佳测量条件组合。传统的单因素法筛选出来的测量条件之间往往会存在一定的交互作用,实验量很大且不能得到满意的结果。而RSM是一种多因素分析方法,能够很好地反应测量条件之间的交互作用,且能通过选择合理的设计方式,大幅度减少实验次数,有效弥补单因素法的不足[4]。本研究并未完全摒弃传统的单因素法,而是将其用于重要影响因子和RSM实验区域的确认,创新性地将传统的单因素法与RSM联合起来,获得了良好的效果。

单因素分析的结果表明反应液pH值、4-NPP浓度、AMP浓度为ALP项目的重要影响因子。分析ALP重要影响因子与催化活性浓度测量结果的趋势图,发现单因素分析结果均包括了测量结果最高值,因此,将中等水平即水平3设置为RSM设计的中心点。RSM常用的三种设计方式中,3k因子设计由于实验次数较多,一般较少使用,常用Box-Behnken设计或CCD设计[12]。在本研究中,根据酶学测量的报道[7],考虑其响应曲面是存在的,Box-Behnken设计可对一阶或二阶系数提供更好的估计,因此选择Box-Behnken设计。按Box-Behnken设计方案组合安排实验,以测量结果作为RSM的响应值建立模型并绘制等值线图和响应面图,证明曲面确实存在,且包含最佳测量条件。对所建立的RSM模型的性能评价,主要考虑了模型的拟合度和预测准确度。RSM模型的评价结果表明,所有重要影响因子对测量结果的影响有显著统计学意义(P<0.01),模型拟合效果良好(失拟项P>0.05),模型预测效果良好。各影响因子的一次效应和二次效应对ALP催化活性浓度测量结果存在显著影响(P<0.01)[7]。其中,4-NPP浓度和AMP浓度之间存在显著交互作用(P<0.05),其他影响因子之间不存在明显交互作用(P>0.05)。交互作用的分析结果与RSM等值线图分析结果一致。通过Minitab16软件优化器功能,获得了ALP最佳理论实验条件,并通过了正确度验证。正确度验证结果表明,验证结果与CRM靶值相对偏移能满足其测量不确定度的要求。另外,通过RSM图形分析发现,反应液pH值对ALP催化活性浓度测量结果影响较大,在试剂配制过程中,应严格控制。

本研究成功将RSM模型应用于ALP参考方法测量条件的研究,获得良好的效果,探索了不同影响因子与参考测量结果的关联性及影响因子之间的交互作用,进而为ALP检验项目标准化提供了科学依据。