防控输血传播梅毒的筛查技术应用进展

庞 栋

（南宁中心血站，广西 南宁 530003）

梅毒（Syphilis）作为一种性传播疾病，可经输血传播，临床表现复杂，可累及全身多个器官。据世界卫生组织（WHO）统计，每年约有1 200万梅毒的新增病例，其中发展中国家占90%以上，更为重要的是，近30年调查研究发现梅毒与HIV感染风险呈正相关［1-2］。采供血机构通过对献血者进行筛查、血液低温保存、病原体灭活等技术，可防控输血途径传播梅毒风险。本文就采供血机构对经输血途径传播梅毒的防控技术，包括梅毒血清学检测、分子生物学检测的实验室技术研究进展及其在献血者筛查的应用等方面进行综述。

1 输血传播梅毒的风险

输血传播梅毒的首个病例报道于1915年［3］，其后世界各国陆续有不少输血传播梅毒的案例报道。由于梅毒螺旋体（treponema pallidum，TP）对外界的抵抗力脆弱，对冷敏感，通常输注保存于10℃以下、3天以上的血液制品传播风险非常低［4］。在血液供应紧张的欠发达国家地区，血液制品通常未在低温保存3天以上，因此输血传播梅毒存在一定的风险，如我国现行血小板血液制品通常储存在20～24℃，传播梅毒风险可能更高。此外，近年调查研究发现梅毒与HIV感染风险呈正相关，HIV感染者常合并感染梅毒，故筛查献血者梅毒螺旋体对防止输血传播梅毒非常关键［2，5］。美国采供血机构对经输血途径传播梅毒防控效果显著，1966年后少见输血感染梅毒的案例报道［6］，此得益于采供血机构对献血者进行梅毒螺旋体严格筛查，屏蔽了阳性反应献血者，该措施发挥了关键作用。其次，从低危人群中选择无偿献血者、充足的血液供应、血液经冷藏等技术灭活也起到重要作用。然而，目前在亚洲和非洲等欠发达国家和地区梅毒等性传播疾病仍广泛流行，梅毒螺旋体感染的流行率仍达到25%［7］，血液安全面临严峻考验。杨楠等［8］对2010—2014年兰州地区献血者进行TP阳性分析，结果TP阳性率为0.49%。余桂华等［9］对2008—2011年云南曲靖地区献血者调查分析，结果TP阳性率为0.60%。目前，世界卫生组织（WHO）、国际输血协会（ISBT）以及美国血库协会（AABB）已提出预防输血梅毒的策略，主要包括:选择低危献血者，并使用有效的实验室方法筛查；应用病原体灭活技术；合理使用血液制品。对有高危行为的献血者延迟或停止献血，对于降低经血传播疾病实验室检测窗口期的风险具有重要意义。

2 梅毒实验室检测方法

梅毒的实验室检测方法可分为以下2种:血清学检测和基于分子生物学的梅毒PCR检测方法。

2.1 非梅毒螺旋体血清学试验 该方法由August Von Wassermann于1906年首次报道［10］，主要包括性病研究实验室试验（VDRL）、未加热血清反应素试验（USR）、甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）和快速血浆反应素试验（RPR）等，此类试验方法是基于梅毒感染后人体产生的IgM或IgG与非特异性心磷脂或卵磷脂发生颗粒状凝集反应判断。非螺旋体抗原血清学试验早期在我国采供血机构许可应用于献血者梅毒筛查，然而该法为非特异性血清学试验，受多种因素的影响发生交叉反应，容易出现假阳性和假阴性结果，灵敏度和特异性较差，且需要人工肉眼判断，不易于自动化检测及实验记录的保存。1997年起我国已经取消了非梅毒螺旋体抗原血清学试验用于献血者血液筛查。

2.2 梅毒螺旋体特异性试验 梅毒螺旋体特异性试验的优点是弥补了非密螺旋体试验的非特异性，目前常用的密螺旋体试验包括荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）、梅毒螺旋体血凝测定（TPHA）和酶免疫测定（EIA）。FTA-ABS和TPHA是以梅毒螺旋体Nichols株为抗原，具有灵敏度和特异性高的特点，常用于梅毒筛查阳性结果的确认。而梅毒螺旋体的完整基因组测序研究发现主要的蛋白质抗原（Tp15、Tp17、Tp45、Tp47）具有强免疫原性，并被认为是梅毒血清学诊断的重要靶点。基于最新的酶联免疫（EIA）或化学发光免疫分析（CLIA）同时检测IgM和IgG抗体，与单独检测IgG相比，可提高灵敏度和特异性，从而缩短检测窗口期［11］。

2.2.1 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）TP-ELISA法最早采用全血溶解产物作为抗原包被在微孔板上，加入待检血清和酶标抗体，检测献血者血浆中抗TP特异性抗体，后来使用重组抗原代替野生抗原的ELISA试剂盒，有效提高了检测灵敏度，梅毒检测的主要膜蛋白主要包括Tp15、Tp17、Tp45和 Tp47 等［12］。Van voorhis 等［13］发 现 重 组 Tp92、Tp0257、Tp0453均具有很强的免疫原性，均可分别应用于ELISA检测的评估，与传统血清学检测结果吻合，可成为Tp抗体的备选抗原。Smith等［14］筛选Tp0453和Tp0326组成的嵌合物作为包被抗原建立ELISA法，发现联合应用Tp0453和Tp0326重组蛋白可提高灵敏度和特异性。曾铁兵等［15］、伍宁等［16］分别采用rTp0971、rTp0821蛋白包被微孔，建立间接ELISA法用于检测临床血清样本，结果rTp0971-ELISA特异性为100%，敏感性为89.1%；与rTp0821-ELISA的结果符合率达95.6%，表明二种蛋白具有良好的抗原性，可应用于TP抗体检测。此外，Long等［17］通过研究发现，重组Tp0965抗原在梅毒发病的各临床阶段的灵敏度都比较高。然而研究表明梅毒患者治愈后，体内特异性抗体TP-IgG在相当长的时间内仍可存在，甚至终身维持。因此，TP-ELISA阳性只能说明曾经感染过或正在感染梅毒，很多TP-ELISA阳性的献血者可能为梅毒治愈者，但是却仍然被屏蔽不能献血和所献血液报废，对保护献血者权益和保留固定献血者产生不利影响。

2.2.2 蛋白免疫印迹法（Western blot，WB） 梅毒螺旋体检测的蛋白印迹与HIV抗体确认的蛋白印迹试验方法类似，都提供了特征性分子条带。如检测到分子量为15.5kDa、17kDa、45kDa和47kDa的三种以上主要抗原即可确认Tp阳性结果。WB既可以检测IgG也可以检测IgM抗体，是一项用于梅毒检测的确证试验［18］。然而该法人工操作步骤复杂，难以适应采供血机构需要的快速全自动检测，多在科研机构病原实验室使用，很少在采供血的血液筛实验室应用。

2.2.3 化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA） CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶等的检测分析技术。该技术具有灵敏度高、线性范围宽、试剂稳定、无污染和衰变、检测耗时短和自动化程度高等优点。《血站技术操作规程（2015版）》提出化学发光免疫分析试验可用于献血者的血清学检测［19］。Tao等［20］应用罗氏公司Elecsys电化学发光免疫测定法、雅培公司Laboratories Architect化学发光微粒免疫测定法以及中国常用的InTec和KHB酶联免疫吸附测定法检测比较了13 767份血清样本，并用免疫印迹法确认阳性测试结果。罗氏Elecsys免疫测定的灵敏度为100%，雅培 Architect为98.26%，InTec为99.11%，KHB为98.56%。罗氏Elecsys免疫测定法的特异性为99.81%，雅培Architect为99.74%，InTec与KHB分别为99.93%与99.80%。对于临界值样本，与其他测试相比，Elecsys免疫测定法无假阴性结果，假阳性结果更少。

2.2.4 胶体金免疫层析法（colloidal gold immunechromatography，GICA） GICA应用纯化重组梅毒抗原，用胶体金标记，使其在硝酸纤维素膜上反应，以双抗原夹心法快速检测血清梅毒螺旋体特异性抗体。徐长根等［21］应用GICA筛查60 402名献血者，并与TP-ELISA相比较，阴性合格率为99.7%，阳性符合率为72.0%；TP-GICA阴性符合率为99.8%，阳性符合率为67.0%。

2.2.5 梅毒PCR检测技术 PCR作为重要的分子生物学实验技术，广泛用于病原体检测。目前PCR扩增梅毒螺旋体的DNA片段主要是针对编码Tp0574（tpp47）、Tp1016（bmp）、Tp0105（polA）、Tp0117（tprC）、Tp0319（tmpC）、Tp0136、Tp0548 等梅毒螺旋体特异性抗原的TpDNA的开放编码区。在感染早期血清学检测无反应时PCR即可识别梅毒螺旋体，显著缩短检测窗口期，更为重要的是PCR可以区分梅毒螺旋体感染和其他螺旋体感染，降低假阳性率［22］。目前实验室应用于梅毒检测的PCR方法有常规PCR、巢式PCR（Nested PCR）、荧光定量PCR（realtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR）、多重PCR（multiplex PCR，M-PCR）和逆转录-PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）等。荧光定量PCR应用比较广泛，其原理是在PCR体系中加入一段与目的扩增序列互补，二十几个碱基的荧光探针——寡核苷酸。伴随PCR目的基因扩增，Taq酶5'端至3'端外切酶活性使探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，最终检测到报告基团发出的荧光。PCR反应中每扩增出一条产物就会有一个荧光分子形成，荧光的累积和PCR产物的形成同步。因此，通过检测PCR荧光值的变化即可准确反映扩增产物的拷贝数。基于PCR检测的优越性，2014年欧洲梅毒管理规范提出实验室要广泛应用PCR检测［23］。目前，我国采供血系统仅将PCR技术应用于HIV、HBV及HCV的检测，TP尚未列入核酸检测项目。随着研究发现灵敏度和特异性更高的TP靶基因，PCR技术将大规模应用于献血者血液检测。

3 结 语

综上所述，虽然我国采供血机构输血传播梅毒相关检测技术应用方法有很多种，但是仍然缺乏可以检测梅毒各个临床阶段的金标准方法。梅毒患者治愈后，体内特异性抗体TP-IgG抗体相当长的时间内仍可存在，甚至终身维持，因此，TP-ELISA反应性并不代表献血者正在感染梅毒。美国食品和药品监督管理局（FDA）于2013年颁布了针对抗-TP筛查反应性献血者的归队指南，中国输血协会血液质量管理工作委员会于2015年发布了反应性献血者屏蔽与归队指南，既往感染梅毒经治愈一定时间的献血者，经过评估后将可再次献血。随着重组抗原TPELISA、WB、化学光免疫测定技术及荧光定量PCR等新技术的应用，对进一步提高献血者梅毒检测的灵敏度和特异性，防控输血传播梅毒，确保血液安全具有重大意义。