调节性B细胞在过敏原免疫治疗中的机制研究进展

王承倩 郑跃杰 马卓娅

汕头大学附属深圳市儿童医院呼吸科518038

过敏性疾病即变态反应性疾病,包括湿疹、过敏性鼻炎、过敏性哮喘,过敏性结膜炎、食物过敏等,近几十年来逐渐增加,引起了全世界的高度关注。针对过敏性疾病的治疗,目前主要为药物对症治疗 (包括抗组胺药物、糖皮质激素、白三烯受体调节剂)和过敏原免疫治疗(allergen immunotherapy,AIT)。与对症药物治疗相比,AIT 是唯一可能改变过敏性疾病自然进程的对因治疗,可以阻止儿童过敏性鼻炎进展为过敏性哮喘,并且疗效可在疗程结束后维持数年时间[1-3]。目前常用的AIT 方法有皮下免疫治疗 (subcutaneous immunotherapy,SCIT)和舌下免疫治疗 (sublingual immunotherapy,SLIT)两种。

当前AIT 的机制尚不完全清楚,主要有以下几种观点[4-6]：(1)肥大细胞和嗜碱粒细胞早期脱敏的诱导 (活化阈值的改变); (2)促进调节性T 细胞 (regulatory T lymphocytes,Tregs)和调节性B 细胞 (regulatory B lymphocytes,Bregs)的产生; (3)Ig E 和IgG4 的调节;(4)Th1/Th2失调的纠正;(5)抑制嗜酸粒细胞的活化和迁移等。其中Bregs 与Tregs 是重要的作用细胞。关于Tregs的作用机制,既往已有较多研究,而且关于Bregs,现有的研究更多地集中于其在自身免疫性疾病中的作用机制,对其在AIT 中的机制研究相对较少,本文将对Bregs在AIT 治疗过程中的研究进展作一综述。

1 调节性B细胞

1.1 Bregs的分类及亚型 Neta等[7]在迟发性超敏反应豚鼠模型中发现了一类抑制性B细胞,可以抑制T 细胞的功能。Wolf等[8]在小鼠实验性自身免疫性脑炎模型中发现,缺乏调节性B 细胞的小鼠,不能从该病中恢复,提示Bregs免疫抑制功能的重要性,因此Bregs逐渐引起人们关注。此后,在自身免疫性疾病[9]、病毒感染、外科疾病[10]等多种疾病中均开展了关于Bregs的研究,对Bregs的分型、细胞因子、表面标志、作用机制等研究不断深入。目前发现,Bregs并不是一种单一表型的细胞,我们很难找到某一种特定的标志来定义区分它。从幼稚B细胞,到未成熟B细胞,再到分化成熟的B 细胞、浆细胞,均可发现Bregs的存在,因此其具有表型多样性的特点[6]。目前在人类中发现的亚型主要有[11-12]：(1)B10/前B10细胞,是最多见也是研究最深入的Bregs,由Yanaba等在野生型小鼠脾内分离出,表达CD5+CD1dhi,占小鼠脾内B 细胞的1%～3%,人类外周血中B10 细胞比例在童年期间高达30%,远远高于健康新生儿 (3%～4%)和成年人 (7%～9%),其表达CD24hiCD27+CD148hiCD48hi,主要通过分泌IL-10产生抑制作用[13-14]; (2)Br1 细胞,表达CD19+CD25hiCD71hi,在外周血中发现特异性产生高水平的IL-10和IgG4,并有效抑制抗原特异性CD4+T 细胞增殖[15];(3)过渡B细胞,表达CD19+CD24hiCD38hi,在外周血及炎症局部发现,也可产生IL-10; (4)表达CD27intCD38+的浆细胞,可产生IL-10和免疫球蛋白[16];(5)产生转化生长 因 子 β (transforming growth factor-β,TGF-β)的Breg(Br3),在小鼠肠炎模型中发现,表达CD5+CD19+CX3CR1+[17]。

1.2 细胞因子 Bregs 主要通过产生IL-10、TGF-β、IL-35及表面结合和细胞内分子,包括CD19、CD21、CD23、CD24、CD5、CD62L、MHC-Ⅱ、fas配体、T 细胞免疫球蛋白、程序性死亡配体、黏蛋白结构域 (TIM)-1、CD138、细胞内信号转导分子信号转导、转录激活因子3以及髓系分化反应基因88 等表达免疫负向调节作用[18]。其中主要的细胞因子有以下几种：

1.2.1 IL-10 IL-10是一种重要的抑制性细胞因子,多种细胞 (单核细胞、T 细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、肥大细胞、B 细胞)均可产生,高产IL-10 的Treg称为IL-10分泌1型调节性T (Tr1)细胞,Bregs的多种亚型均可产生该因子,主要有B10 细胞和Br1 细胞[19]。它有着极为强大的免疫抑制功能,不仅在建立对变应原的外周耐受性中起重要作用,而且在保护宿主免受对病原体以及自身免疫疾病的过度炎症反应、调节B 细胞存活、类别转换重组和浆细胞分化中均有一定作用。对于T细胞来说,IL-10通过抑制炎性细胞因子、趋化因子和趋化因子受体的产生,以及抑制单核/巨噬细胞和树突状细胞上MHC-Ⅱ和共刺激分子CD80/CD86的表达,可进一步抑制CD4+T 细胞的增殖。而对B细胞来说,IL-10可以诱导其存活、扩增和分化,并在诱导Ig G4产生和抑制Ig E中起主要作用[15,20]。Stanic等[21]用人IL-10 转染原代人B 细胞,采用ELISA、磁珠测定法、流式细胞术 (flow cytometry,FMC)和定量实时荧光聚合酶联反应等技术,发现过表达IL-10的B细胞可以降低促炎性细胞因子 (TNF-α、IL-8和巨噬细胞炎性蛋白1α)的水平,并且增强了抗炎性IL-1受体拮抗剂和血管内皮生长因子的产生,同时,该类细胞分泌IgE较少并且有效地抑制外周单个核细胞中的促炎细胞因子产生、单核细胞衍生的树突细胞的成熟和体外抗原特异性增殖,表明IL-10在诱导B 细胞免疫调节表型中发挥重要的抗炎和免疫抑制作用。

1.2.2 TGF-β TGF-β也是一种具有强大免疫调节能力的多效性细胞因子,在伤口愈合,组织重塑和免疫调节及抑制免疫反应方面具有非常重要的作用,特别是可以诱导和维持过敏原的外周耐受[22],Treg细胞是TGF-β的主要来源。TGF-β通过多种途径抑制B 细胞和效应T 细胞的增殖、分化和生存。尽管TGF-β抑制了大多数免疫球蛋白的类别转换,但它可以促进小鼠模型中分泌Ig A 的浆细胞的分化、促进朗格汉斯细胞、树突状细胞和巨噬细胞的成熟[20]。近年来发现Bregs也可以产生该类细胞因子,Wu等[23]在20例食物过敏患者和20例健康个体的对照研究中发现,在食物过敏组的患者外周血标本中,表达CX3CR1、可以产生TGF-β的B细胞水平明显低于健康个体组,提示B细胞来源的TGF-β可能在食物过敏的耐受诱导中起关键作用。Tordesillas等[24]选择C3H/HeJ小鼠通过口服或通过皮肤致敏卵清蛋白建立过敏模型,给予表皮或口服途径进行AIT,采用FMC比较各细胞水平,结果提示过敏小鼠胃肠道因组织缺陷,从头生成Treg细胞不足,而表皮特异性免疫治疗可诱导对过敏反应的持续保护,提示保护机制是一种新的途径——直接TGF-β依赖性Treg细胞抑制肥大细胞活化,而这种作用不依赖调节T 细胞或B 细胞应答。

1.2.3 IL-35 IL-35是近几年新发现的一种重要的免疫抑制细胞因子,属于IL-12细胞因子家族成员,通过诱导调节性细胞和抑制Th细胞,在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用[25]。最初认为该细胞因子仅由Tregs特异性产生,并被发现有助于Tregs的抑制功能[26]。Shen等[27]发现B细胞不表达IL-35的小鼠不能从T 细胞介导的实验性自身免疫性脑脊髓炎中恢复,且表现出显著提高的对细胞内细菌病原体鼠伤寒沙门氏菌感染的抗性,提示了产生IL-35的B细胞在免疫调节中的重要性。

1.2.4 CD1d CD1d是一种多数Bregs表达的非多态性主要组织相容性复合体I类抗原呈递分子,Oleinika等[28]发现,在嵌合小鼠实验性关节炎模型中由Bregs表达的CD1d可提呈脂质抗原诱导不变性自然杀伤T 细胞 (invariant NKT,iNKT)细胞分泌干扰素-γ,有助于下调 Th1 和Th17免疫反应和改善实验性关节炎症状,指出Bregs可通过该途径抑制过度炎症。

2 调节性B细胞在AIT中的研究进展

2.1 Bregs与Tregs Tregs是一类对体内炎症及自身免疫反应有抑制作用的T 细胞亚群,1995年Sakaguchi等[29]发现Tregs具有强大的免疫抑制作用,可促进自体免疫耐受并维持免疫系统平衡,它的功能失常与自身免疫性疾病的发生关系密切[30]。AIT 的目的是诱导和维持无害环境和自身抗原的免疫耐受,在这一过程中诱导生成Tregs是极为重要的一步[31]。关于Tregs在AIT 中的免疫调节机制,既往已经研究颇多[5,30],对B 细胞来说,Tregs除了可以产生与之相似的IL-10、TGF-β、IL-35 等细胞因子,还可诱导过敏原特异性Ig G4 和抑制过敏原特异性IgE 的产生。Bregs主要通过分泌细胞因子对Tregs进行调节。最初主要在猫主人和养蜂人中进行了关于免疫耐受的研究,发现对变应原健康反应的特征是诱导产生IL-10的Tr1细胞和阻断型IgG4抗体,而过敏反应为Th2 型细胞及IgE 的过度产生[32]。Suárez-Fueyo等[33]通过对58例成人花粉过敏患者在舌下脱敏治疗过程中外周血中细胞因子的变化用流式细胞术进行分析对比后发现,Tregs细胞水平在外周血中明显增多。Yamanaka等[34]将对柳杉花粉过敏的患者 (29例)分为安慰剂对照组及舌下脱敏治疗组,治疗组接受预防性舌下脱敏5个月后花粉症的发生率明显下降,而通过流式细胞术分析,提示Tr1 细胞、Br1 细胞在治疗组和对照组均增加。Amu等[35]将来自蠕虫感染的小鼠脾脏产生IL-10的B细胞进行表型分离,转移至卵清蛋白致敏小鼠,发现产生IL-10的B 细胞可以通过诱导Tregs细胞,防止卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症。同样,Kim 等[36]通过建立牛奶酪蛋白诱导小鼠食物过敏模型,发现小鼠肠系膜产IL-10的调节性CD5+B 细胞通过调节Treg细胞抑制小鼠牛奶酪蛋白诱导的过敏性反应,这种作用是1L-10依赖性的。Liu等[17]通过建立肠道Th2炎症小鼠模型,用流式细胞术对肠道的一群耐受性B 细胞 (tolerogenic B cells,TolBCs)进行免疫调节作用分析,发现该群细胞表达CX3CR1、CD5+、CD19+,可以产生TGF-β,用Th0细胞与TolBCs亚群共培养可产生CD4+CD25+Foxp3+Treg,而TolBCs的过继转移则显著抑制了小鼠食物过敏引起的小肠Th2 模式炎症。提示该群细胞能够在小肠中诱导Tregs,同时抑制小鼠食物过敏相关的Th2 模式炎症。而Shen等发现Breg产生的IL-35可以诱导Tregs的扩增[27]。

2.2 Bregs与滤泡型辅助性T 细胞 (follicular T helper,Tfh) Tfh是一种CD4+T 细胞,表达B 细胞滤泡归巢趋化因子受体CXCR5,通过细胞接触机制 (CD40L、ICOS等)及分泌细胞因子 (IL-21),Tfh诱导和促进抗原特异性B细胞免疫球蛋白的类别转换及高亲和力抗体的产生[37]。目前已知在机体循环中有3个Tfh细胞亚组：Tfh1、Tfh2和Tfh17。黄璇等[38]选取25 例急性发作期、20 例缓解期哮喘患者及20例健康对照者作为研究对象,经FMC 检测外周血中循环Tfh百分率,ELISA 法检测血清中总IgE 水平,发现Tfh 细胞数量在哮喘患者中明显增多,尤其是Tfh2细胞,比率 (Tfh2/Tfh1)与血液中总IgE 水平呈正相关。Kamekura等[39]在23例鼻炎患者、19例鼻炎合并哮喘患者和24例健康对照者的外周血标本中,亦发现有相似的现象,过敏性鼻炎患者外周血标本中的Tfh增多且明显偏向 Tfh2 细胞,且与Bregs 的减少呈正相关。Coquet等[40]在粉尘螨致敏的小鼠模型中发现,Tfh 分泌的IL-21促进了肺部的2型炎症,加强了Th2细胞因子的产生及功能。因此,有理由认为过敏性疾病与Tfh 功能亢进有关。人类T 细胞在IL-12和IL-21存在下多克隆刺激可产生Tfh细胞,Tfh可诱导B细胞最终分化为浆细胞和记忆B细胞。新近Achour等[41]根据这一基础进行了人体外细胞培养实验,纯化来源于儿童扁桃腺组织和成人脾脏组织的T、B细胞,用IL-12和IL-21 刺激培养幼稚T 细胞,得到Tfh细胞,同时刺激培养得到Bregs,将二者共同培养,采用流式细胞技术和ELISA 检测该过程中各相关细胞、细胞因子及免疫球蛋白水平,发现Bregs可抑制Tfh的产生和功能,扩大滤泡调节性T 细胞 (follicular regulatory T,Tfr)数量,并抑制Tfh细胞介导的抗体分泌,提示Bregs细胞可以通过调节Tfh细胞来干扰生发中心反应,抑制免疫应答。

2.3 Bregs产生的IgG4 在人类B细胞表达IgG 的4个亚类 (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)中,IgG4是血清中含量最少的一类,约占B 细胞IgG 总量的4%,但其水平在AIT治疗中可高达75%[42],由Br1细胞特异性产生[15]。Br1可通过IL-10介导的抑制作用并将体液应答导向IgG4来促进AIT 期间的变应原耐受,也可特异性地上调IgG4产生[32]。IgG4有一些独特的特点,使之在免疫耐受中发挥重要作用：首先IgG4抗体通过具有不同特异性的IgG4分子之间的交换重-轻链对来交换Fab臂 (因此可称其为动态分子),这导致双特异性抗体的产生,使之具有显著降低的交联能力;其次IgG4铰链区的特定结构对某些Fcγ受体亲和力较低,并且IgG4不能固定补体;最后,IgG4是阻断性抗体,其通过与Ig E竞争结合于抗体而阻止效应细胞的活化和脱颗粒[43]。在AIT 期间过敏原特异性IgE 的初期表现为升高,随后逐渐降低,同时过敏原特异性IgG4抗体则逐渐增加,在连续使用过敏原的AIT 过程中,血清IgG4 明显增加,导致过敏原特异性IgE∶IgG4 比例降低,对于AIT,临床症状的改善往往发生在血清Ig E 降低之前,因此疗效并不与特异性IgE 水平的降低相对应。因此,AIT 似乎诱导了保护性免疫应答,而不是通过减少IgE 起作用。只有长期来看,这种保护性免疫机制才可能导致IgE 的减少[30]。虽然在停止AIT 治疗1年后,免疫反应性IgG/IgG4水平减少了80%至90%,但IgG 相关的对血清Ig E抑制活性仍会坚持数年,显示了持续的免疫耐受效果[44-46]。

2.4 其他 此外,Bregs还可以通过抑制效应T 细胞增殖和细胞因子的产生来支持AIT。Bregs可以直接抑制效应T细胞,也可以通过分泌IL-10等细胞因子抑制树突状细胞间接抑制效应性T 细胞。已经在过敏原耐受性方面进行了研究的人类Bregs子集是Br1 细胞,Wu等[23]收集对比了20例鸡蛋过敏患者 (男女比例1∶1)和10例健康成人的外周血标本,采用流式细胞术、ELISA 及实时荧光PCR 等技术,发现表达CX3CR1 的B 细胞 (Br1)可通过分泌TGF-β有效地抑制抗原特异性效应CD4+T 细胞的增殖。Braza等[47]在屋尘螨诱导过敏性哮喘小鼠模型中,采用转录组学和表型分析,发现过继转移小鼠CD9+Breg细胞后可以经IL-10依赖性方式抑制Th2和Th17驱动的炎症来使气道炎症和肺功能正常化,从而恢复肺组织中有利的免疫学平衡。进一步研究显示,注射CD9+Breg可控制肺效应T 细胞的扩增,从而允许在肺中建立有利的Tregs/效应T 细胞比例。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突