循环肿瘤细胞在肺癌临床应用中的进展研究

王晓昱 徐兴祥

1大连医科大学116041；2苏北人民医院呼吸科，扬州225001

肺癌是最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率分别位居恶性肿瘤排行的第2位和第1位[1]。有研究显示，肺癌患者5年生存率低于20%[2-3]，其5年生存率与临床诊治及疗效监测等密切相关。而液体活检作为一种便捷、非入侵性、能够动态反映肿瘤基因谱全貌的方法，在肺癌精准医疗中发挥着举足轻重的作用。其中血液循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)检测作为开展最早的液体活检技术，现已经在肿瘤早期诊断、制定个体化治疗策略、预后判断以及疗效评估等方面获得了广泛应用。

1 检测CTCs的优势

1.1 对肺癌的诊断 目前常用于肺癌检查的方法主要包括影像学检查、血清肿瘤标志物检测、组织病理学检查等，但这些方法在诊断肺癌以及实时监测疗效等方面有很明显的缺陷。通常，影像学改变在时间上存在一定的滞后性；血清肿瘤标志物检测缺乏特异性；组织病理学检查则需局部穿刺取材，有时为明确诊断甚至需反复多次活检，而大部分肿瘤患者并不能接受反复多次穿刺，因此这些方法在早期发现肺癌方面的能力有限，目前约有67%的肺癌确诊时已为晚期，失去了手术机会[4]。而CTCs相较于上述方法有明显优势。(1)早期诊断：CTCs能够早于影像学发现更小的肿瘤[5]； (2)辅助确诊：CTCs计数可作为辅助诊断指标，用来判断肿瘤的良恶性； (3)辅助分型分期：近年来，CTCs检测在临床上的应用使其成为了对TNM传统分期系统的有效补充[6]，从而可拟定下一步治疗方案。

1.2 对肺癌疗效的评价 在治疗肺癌过程中，需要全程进行疗效评价，RECIST标准是目前最常用的疗效评价标准。但是，肿瘤病灶一般在治疗后2个月左右才能出现影像学检测的改变，因此根据RECIST标准评价到的结果在时间上存在一定的滞后性[7]。这不利于肿瘤进展的早期发现，还会影响患者的预后。而检测CTCs有一定的优势。 (1)快速评估疗效：根据CTCs数量判断治疗效果，简便、快速、无创[8]；(2)辅助评估生存期：CTCs个数用来预估存活时间，是一个较好的量化指标； (3)疗效实时监控：实时监控放化疗的疗效，根据CTCs的数量判断是否产生耐药或者转移复发，从而有益于及时调整用药。

2 检测CTCs计数存在的问题

虽然CTCs计数在临床上得到了较为广泛的应用，但是CTCs计数也存在一定的缺陷。CTCs是一种细胞，同时也是一个高异质性的细胞群，很大一部分进入血液中的CTCs会凋亡，只有很小一部分细胞能够幸存并发生转移，但正是这一小部分具有转移潜能的细胞是我们最需要关注的重点。随着肿瘤的不断发生、发展，CTCs的组成也在不断变化，故单纯检测其计数已经不能准确反映这种变化。目前，CTCs入血以及血浆清除机制尚未明了，在收集标本时，各个环节 (采血时间、部位、标本储存等)都会影响到CTCs计数的准确性。因此，研究者将目光转向了CTCs的生物学特性研究，该研究进一步加深了人们对CTCs的认识，使人们能够更加精准地捕捉和分析CTCs，从而为肿瘤的精准治疗提供更加可靠的诊治及预后判断的证据。

3 CTCs生物学特性

3.1 CTCs的增殖和休眠 大多CTCs在循环过程中处于休眠期，在休眠期间还有一部分会发生凋亡，因此只有少部分CTCs最终能够形成转移灶。由于CTCs的半衰期较短暂，仅为1～2.4 h[9]，故CTCs在外周血中的存在依赖于细胞复制和凋亡之间的平衡。因此，外周血中的CTCs是以活化和休眠2种状态存在，但目前所用的检测方法难以将两者区分开来。同样，对于是否有CTCs处于分裂期也无法判断。若能明确CTCs的状态与分期，便能实现个体化治疗。有研究提示，某些处于活动期的CTCs能分泌细胞角蛋白19和黏蛋白1，可通过上皮免疫斑点法将其在外周血中检测出来[10]。通过检测CTCs凋亡早期相关蛋白M30与细胞角蛋白 (cytokeratin，CK)，进一步计算它们的比值可评估CTCs中活跃细胞所占的比例[11]。另有一项研究提示，若检测CTCs中Ki-67(Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中不可缺少，Ki-67标记的是处于增殖周期中的细胞)表达水平很低或缺失，则提示该类CTCs可能为休眠肿瘤细胞，无法进入细胞分裂周期，而该类CTCs因对现有化疗药物应答率较低，故可以耐受化疗而存活[12]。还有研究发现，处于休眠状态的CTCs在经过若干年后可重新形成转移灶[13]。因此，还需要研究者努力探寻能够反映CTCs增殖与凋亡的标志物，才能更好地制定治疗方案。

3.2 发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的CTCs CTCs是由实体瘤或转移灶释放入血的肿瘤细胞。在此过程中，肿瘤细胞上皮标志物表达下降，间质标志物表达上升，细胞黏附性丢失、运动性增强，从而CTCs获得更强的迁移和侵袭能力，这一现象与EMT密切相关[14]。而肿瘤细胞在转移到远处器官后，可以发生间质上皮转化，从而再次转变为上皮形态，在器官中定植，形成与原发肿瘤组织形态相同的继发克隆[15]。有研究表明，EMT在肿瘤的进程和转移过程中发挥重要作用。发生EMT后，上皮细胞黏附分子E-钙黏素缺失，间质细胞相关标记物N-钙黏素、波形蛋白 (Vimentin)、ZEB1、LEF-1等表达上调，上皮细胞进而转变为具备更强的迁移和侵袭能力的间质细胞，继而参与肿瘤的复发、转移及耐药的过程[16]。

对EMT的进一步研究[14-15]发现，完全间质型的肿瘤细胞容易入血但是不容易发生远处转移。而介于上皮型和间质型的肿瘤细胞可能具有肿瘤干细胞 (cancer stem cells，CSCs)样的特征[16]。因此，对CTCs进行上皮和间质的分型更有助于认识CTCs的生物学特性。Yu等[17]对11例乳腺癌患者CTCs进行检测及分析后发现：CTCs可以分为上皮型、间质型和上皮-间质混合型3种类型，其中以上皮-间质混合型居多。不同类型的CTCs在治疗过程中会发生变化，治疗初期，上皮型向间质型转化，该期间治疗有效，到了治疗后期，间质型CTCs逐渐增多，则发生了耐药，因此CTCs的上皮型和间质型转化可以作为检测肿瘤治疗过程中是否发生耐药的标志物。Liu等[18]报道称，乳腺癌CTCs有明显的上皮样 (ALDH+)和间质样 (CD24-/CD44+)表型，前者位于更中心位置，后者则位于癌入侵边缘 (与基质的毗邻处)，间质型CTCs具有更强的侵袭和转移能力。

3.3 具有CSCs特性的CTCs CSCs是一小部分存在于肿瘤组织中的具有自我更新能力及分化潜能的干细胞性质的细胞亚群，也是导致恶性肿瘤转移及复发的根本原因[19]。很多研究表明，CSCs持续存在于肿瘤中，能够通过干细胞的自我更新和向多种细胞类型分化发展，在肿瘤发生发展、转移及复发和放化疗耐药等方面具有重要作用[20-22]。

CSCs转移能力很强，在血中也更易存活，因而它在CTCs研究中具有更重要的意义。本课题组在前期研究中，利用CK、Vimentin双标进行CTCs鉴定，发现大多阴转的CTCs Vimentin表达明显增加，CK阴性、Vimentin阳性的CTCs CD133、Oct4表达阳性，从而进一步证实EMT可能参与CTCs CK的阴转，CK阴转的CTCs细胞干性增强。越来越多的研究显示[23-25]，部分CTCs在生物学特性上具有同CSCs相似的特点，并且少部分CTCs中可检测出CSCs标志物的表达[26]。此外，也有研究发现，在诱导EMT的过程中可以产生具有CSCs样特征的CTCs，这类CSCs样CTCs的自我更新能力和侵袭能力更强，对药物也存在更高的耐受性，且更易出现复发和转移[27]。因此，对CTCs进行生物学特性研究，从CTCs中寻找出真正能够形成转移的亚群细胞，筛选出具有CSCs特性CTCs亚群的标志物，将会十分有利于CTCs的检测。

4 小结及展望

随着对CTCs研究的逐步深入，关于CTCs的研究有助于了解其在肺癌耐药以及复发转移等方面的作用，从而为肺癌早期诊断、个体化治疗方案的制定、预后评估以及远处转移的风险预测等提供更可靠的依据。但是，在CTCs研究的过程中还存在几个问题：(1)关于CTCs生物学特性变化以及不同CTCs之间在转录组、基因组、表观遗传组的差异的研究较为稀少，这应是我们近期研究的重点。(2)目前尚缺乏一种完善的CTCs分离技术。现有的技术或多或少都存在一部分问题，例如无法获得足量的CTCs、分离出的CTCs纯度较低、获得的CTCs活性被破坏以至于后期无法进行培养、无法分离出全部类型的CTCs。(3)CTCs富集、分离和鉴定的方法有多种，各种检测方法的结果存在较大差异，这就使所得数据很难进行比较，临床也没有固定的参考值。因此，需要建立统一标准的检测方法和参考值，才能进一步比较和研究。相信随着生物科学技术的不断发展，以上问题将被一一解决，而关于CTCs的研究也将不断深入，继而更全面地应用于临床实践。

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