microRNA作为妊娠糖尿病标志物的研究进展

郑妙艳 石文琦 张美琳 单春艳

1天津医科大学代谢病医院糖尿病肾病科，国家卫生健康委员会激素与发育重点实验室(天津医科大学)，天津市代谢性疾病重点实验室，天津医科大学代谢病医院内分泌研究所 300070; 2天津医科大学公共卫生学院 300070

妊娠糖尿病(GDM)是指在妊娠中、晚期首次出现或发病的不同程度的糖耐量异常[1]。在妊娠中、晚期，为了给胎儿提供足够的营养物质，孕妇胰岛素抵抗生理性增强以维持血糖稳态。GDM以糖耐量降低和血糖升高为特征，β细胞对外周胰岛素抵抗的适应不良可能是其主要病理生理机制。目前推荐在妊娠24～28周进行75 g口服葡萄糖耐量试验筛查和诊断GDM，而妊娠中、晚期已出现极高的妊娠相关不良事件发生率，如先兆子痫、早产、胎儿低血糖、呼吸窘迫综合征、子代糖尿病等。所以需要寻找一些生物标志物早期预测GDM或精确监控GDM的状况，以改善GDM不良妊娠结局。研究发现，microRNA(miRNA)可以作为早期诊断GDM的潜在生物标志物[2]。深入研究miRNA的功能，可以增加对GDM及其并发症的病因学和病理生理学的了解。本文对近几年来GDM患者胎盘、循环miRNA方面的研究进展进行综述。

1 miRNA概述

miRNA是一种长度约19～24个核苷酸的内源性非编码单链RNA片段，其生物发生的过程为：首先，在细胞核内，miRNA基因间区域和启动子在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ作用下进一步加工，转录生成含60～70个核苷酸长发夹结构的初级miRNA；随后，后者主动转运至细胞质，在核糖核酸酶Ⅲ Dicer作用下分裂形成两条双链RNA，其中主链编码Argonaute蛋白1-4，形成RNA诱导沉默复合体。成熟的miRNA引导RNA诱导沉默复合体与目标mRNA分子3′非编码区域互补配对，负反馈抑制目标mRNA的翻译或者特异性地切割目标mRNA，从而实现对靶基因转录水平的调控[3]。

miRNA还可被动或主动分泌至细胞外液。细胞死亡或凋亡后miRNA多以无囊泡的形式或凋亡小体被动释放；主动转运则通过囊泡、外泌体或高密度脂蛋白、低密度脂蛋白主动分泌。miRNA以脂质囊泡作为载体或与结合蛋白质形成复合体，可保护其免受RNA酶和其他RNA降解剂的降解，从而使miRNA在细胞外稳定存在[4]。循环miRNA容易检测，所以可作为很多不同疾病(包括糖尿病)公认的诊断、预后、治疗的生物标志物。

2 GDM胎盘miRNA

人类胎盘中有500种以上miRNA表达，可分为胎盘特异性、胎盘相关性和胎盘衍生性循环miRNA三大类[5]。胎盘特异性miRNA在胎盘组织中特异表达，主要与细胞增殖、凋亡、迁移及滋养层血管生成有关，在妊娠早期胎盘形成过程起调节作用。最近，Ding等[6]对16例GDM和对照组的胎盘进行测序分析，并用定量PCR法对差异表达的miRNA进行验证，发现GDM胎盘共表达281个mRNA和32个miRNA，其生物学关系与细胞发育、功能和器官形态有关。其中，miRNA-138-5p通过靶向转导素β样蛋白(TBL1X)的3′-非翻译区，显著抑制滋养层细胞迁移和增殖，并且miRNA-138-5p和TBL1X的异常表达与胎盘重量显著相关。

胎盘相关性miRNA在妊娠过程中以不同形式在胎盘及其他组织中广泛表达。Cai等[5]最近发现，妊娠早期至晚期胎盘中存在191种不同表达的miRNA：妊娠早期，主要存在与肿瘤形成、血管生成、抗凋亡相关的miRNA；妊娠后期，主要存在与细胞分化、抗肿瘤相关的miRNA。许多研究证明，胎盘特异性miRNA和胎盘相关性miRNA在妊娠并发症如妊娠失败、先兆子痫、宫内发育迟缓、早产以及GDM中表达失调，提示其在这些疾病发病机制中发挥作用[7]。较早的研究发现，胎盘特异性miRNA-518d在非糖尿病以及GDM孕妇妊娠37～40周的胎盘中均过度表达，随后发现miRNA-518可特异性调控GDM患者过氧化物酶体增殖物活化受体-α基因和蛋白的表达，过氧化物酶体增殖物活化受体-α在胎盘中的表达与miRNA-518d呈负相关[8]。GDM患者妊娠晚期的胎盘内皮细胞中miRNA-221和miRNA-222表达明显高于正常妊娠者，并靶向抑制组织间黏附因子1蛋白种类，可能抑制白细胞从血液向胎盘迁移，进而加重GDM患者高血糖导致的炎性反应[9]。

胎盘衍生性循环miRNA主要通过合胞体滋养层，由外泌体等携带释放进入母体循环系统，其在血液中容易监测，可反映胎盘特异性和胎盘相关性miRNA的表达，进而反映妊娠期生理和病理情况。近期发现，miRNA-503在GDM患者胎盘及外周血中均上调；动物实验发现，小鼠β细胞系INS-1中miRNA-503中过度表达会使细胞增生和胰岛素分泌降低，同时促进细胞凋亡。这些结果提示GDM期间，胎盘和β细胞间可能存在以miRNA为基础的特殊交流[10]。

3 循环miRNA与GDM

3.1 循环miRNA与β细胞功能 循环miRNA与β细胞的功能和调节相关，在糖尿病发病机制中起重要作用。早期研究主要关注循环miRNA在1型和2型糖尿病中的表达，只有少部分关于循环血清/血浆miRNA在GDM期间的表达及诊断作用的研究。

2011年，Zhao等[11]发表了第一篇研究循环miRNA与GDM相关的报道。研究者通过TaqMan miRNA阵列微流控卡对24例GDM和24名非GDM妊娠16～19周孕妇的血清进行对比分析。结果发现，与非糖尿病受试者相比，GDM患者血清中3种miRNA(miRNA-29a、miRNA-132和miRNA-222)下调。miRNA-29a靶基因Insig1可能参与血糖稳态的基因如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2的表达[12]。此外，近来研究证明，miRNA-29a和miRNA-222均直接和(或)间接调节葡萄糖转运蛋白4，而后者在血糖控制和胰岛素诱导肌肉和脂肪组织摄取葡萄糖的过程中起关键作用[13]。因此，循环miRNA介导并靶向胰岛素敏感组织的交联效应假说，对于理解GDM发病机制的分子线索尤为重要。

Zhu等[14]使用测序法对10例GDM和10名非GDM妊娠16～19周孕妇的血浆中miRNA的表达进行了评估，发现GDM患者血浆中5种miRNA(miRNA-16-5p、miRNA-17-5p、miRNA-19a-3p、miRNA-19b-3p和miRNA-20a-5p)上调。这些miRNA主要与胰岛素分泌相关的一些通路，如丝裂原活化蛋白激酶信号通路、胰岛素信号通路、转化生长因子-β信号通路和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路有关。然而，Cao等[15]对85例GDM患者和72名非GDM者的研究发现，GDM患者仅miRNA-16-5p、miRNA-17-5p和miRNA-20a-5p在妊娠期间表达上调，并没有检测到miRNA-19a-3p和miRNA-19b-3p的表达有显著差异。据报道，2型糖尿病患者中miRNA-16-5p的靶基因(泛素连接酶4A、Smad家族蛋白1、表皮生长因子受体、肌动蛋白β、核糖体RNA加工蛋白12和发育蛋白2)均下调[16]。另外，胰岛素受体底物1和2也是miRNA-16-5p的靶基因，一方面可调节胰岛素样生长因子-1和胰岛素敏感组织胰岛素信号转导，另一方面胰岛素受体底物1和2可使调节细胞生长的Wnt/β-catenin信号增强，而该信号通路调节障碍已证实可以引起癌症、肥胖和糖尿病[17]。然而，miRNA-16-5p在红细胞中高度表达，溶血时miRNA-16-5p表达可能上调，因此以循环中miRNA-16-5p表达水平来监测GDM进展可能出现误导，故尚不能作为一种可靠的生物标志物。最近在南非人群中进行的研究中却发现，与对照组相比，GDM患者的miRNA-20a-5p明显下降，并且miRNA-20a-5p连同一个或多个糖尿病危险因素可能是GDM的重要预测因子[18]。

一项前瞻性对照队列研究中，检测了36例GDM和80名非GDM妊娠7～23周女性血浆中10种在妊娠及其并发症中起关键作用和(或)与2型糖尿病相关的miRNA，发现较高水平的miRNA-155-5p和miRNA-21-3p与GDM呈正相关，miRNA-21-3p和miRNA-210-3p仅与超重/肥胖GDM特异性相关，而与正常体重或偏瘦的GDM无明显相关。另外，有6种miRNA(miRNA-155-5p、miRNA-21-3p、miRNA-146b-5p、miRNA-223-3p、miRNA-517-5p和miRNA-29a-3p)水平仅与孕男性胎儿的GDM患者相关[19]。

最近研究发现，GDM患者miRNA-657表达明显增加，白细胞介素(IL)-37的表达降低，二者呈负相关；体外研究中，miRNA-657可以靶向调节IL-37，增强单核巨噬细胞的增殖，并可促进脂多糖诱导的IL-6和肿瘤坏死因子-α的产生和核因子-κB的激活，而当外源重组IL-37被用于细胞时这种作用被抑制。提示miRNA-657失调可能通过IL-37/核因子-κB信号转导促进GDM发病[20]。

3.2 循环miRNA与GDM相关并发症 为了探讨GDM与循环miRNA改变对胎儿神经系统发育之间的潜在相关性，Lamadrid-Romero等[21]对12个胎儿神经发育相关miRNA(miRNA-183-5p、miRNA-200b-3p、miRNA-9-5p、miRNA-17-5p、miRNA-30b-5p、miRNA-30c-5p、miRNA-124-3p、miRNA-125b-5p、miRNA-128-3P、has-191-5P、miRNA-1290和miRNA-137)表达进行评估，发现与妊娠早期相比，妊娠中期女性血清中miRNA-193-5p、miRNA-200b-3p和miRNA-125-5p表达水平较高，与GDM无关；而miRNA-137在妊娠晚期的水平高于妊娠前期，揭示了这些与神经发育相关的miRNA存在时间差异性。此外，与对照组相比，GDM患者在妊娠早期miRNA-183-5p、miRNA-200b-3p、miRNA-125-5p和miRNA-1290水平较高，提示这组患者胎儿神经分化和细胞增殖可能发生改变。先前的研究表明，miRNA-183和miRNA-200基因家族调节人胶质细胞瘤细胞的细胞增殖，并参与果蝇视叶中神经上皮细胞增殖和成神经细胞生成之间的平衡[22-23]。此外，miRNA-200可抑制Sox2的表达，降低小鼠中脑/后脑区域神经干细胞的增殖和多能性，强烈提示其在GDM时过度表达可能损害胎儿神经系统发育。因此，Lamadrid-Romero等[21]报道，妊娠早期GDM患者中这些miRNA水平增加，表明胎儿中枢神经系统发育过程中细胞增殖减少和神经元分化增加，证实了先前在小鼠中的研究结果。另外，这些与神经发育相关的miRNA可以在孕妇血清中检测到，这可能反映胎儿在怀孕期间的生理或病理生长。然而在GDM过程中，循环miRNA的这种改变究竟是神经损伤的原因还是结果，还有待进一步研究。

总之，与正常妊娠者相比，无论是胎盘miRNA还是循环miRNA在GDM患者中均存在差异表达。这些差异表达的miRNA影响胰岛素分泌和转运通路、炎性反应、胎儿神经元分化等相关基因的表达，可能参与GDM以及相关并发症的发生和进展。循环中miRNA相对稳定，取材方便，易于分析，目前已筛选出一些可作为GDM的候选生物标志物。但由于标本种类(血清或血浆)、样品处理方法、数据分析方法、种族差异等原因，各研究数据重复性和特异性相对较低。因此，制定全球公认和标准化的操作程序来分析循环miRNA是很有必要的[24]。