波动性高糖对糖尿病视网膜病变的作用研究进展

董天慧，孙建梅，姚舜，邹斌倩，蒲泽南，何雷

近年来，随着糖尿病病人人数逐年上升，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)已成为全球主要致盲原因之一。23.0%的糖尿病病人出现DR[1]，其中非增生性DR及增生性DR发病率分别为19.1%和2.8%[2]。DR的特征性病理改变表现为周细胞丧失和新生血管形成，临床根据有无视网膜新生血管的出现将DR分为非增殖期DR(non-proloferative diabetic retinopathy，NPDR)和增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。目前，已被证实的DR发病危险因素包括糖尿病病程，高血糖，高血压及血脂紊乱。糖化血红蛋白(HbA1c)反映糖尿病病人近2～3个月血糖平均水平，是反映血糖长期控制的指标，美国糖尿病协会将HbA1c作为糖尿病及其并发症预防监控“金标准”[3]，但在长期血糖水平与HbA1c相近的人群中，DR的发生与病程缺乏完全的一致性[4]，且与日内平均血糖漂移幅度有显著关联性，说明波动性高糖所引起的生物效应对DR的危险性的作用可能超过血糖绝对水平的作用。近年来多项研究指出，波动性高糖能通过细胞自噬，细胞凋亡，氧化应激及视网膜组织DNA损伤，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的释放加速糖尿病进程参与DR的发生和进展。笔者就波动性高糖与DR之间的关系进行如下综述。

1 波动性高糖对DR的影响

2013年中国2型糖尿病防治指南中推荐2型糖尿病病人控制目标为HbA1c<7%[5]。但目前很多研究表明，仅仅用HbA1c不足以评估糖尿病病人的血糖控制情况，糖尿病并发症的发生及严重程度还与血糖波动有关。波动性高糖，又称血糖漂移，是糖尿病病人的血糖在较高水平基础上围绕均值上行、下行双向的急性波动，被认为是监测短期血糖变化的主要指标，并可通过自测血糖系统(self-monitored blood glucose，SMBG)或动态血糖监测系统(continuous glucose monitoring system，CGMS)获取血糖波动水平[6]。王程琳[7]采用CGMS监测60例HbA1c值无明显差异的2型糖尿病病人的连续72 h血糖，发现DR病人的平均血糖水平，平均血糖波动幅度和日间血糖平均绝对差均高于眼底正常的2型糖尿病病人，提示血糖波动是DR发生的重要因素之一，且较HbA1c的预测更为准确。另有研究表明，NPDR病人血糖波动系数及糖尿病病程明显小于PDR病人，但两组HbA1c及空腹血糖差异无统计学意义，提示血糖波动也是预测DR病程进展的独立危险因素之一[8]。有学者认为，在慢性高糖状态下，细胞可通过反馈调节部分拮抗高糖毒性作用，而当细胞处于葡萄糖浓度强烈波动状态时，该适应性调节作用减弱，导致高糖毒性增强。因此在糖尿病病程较长的DR病人中，应重视病人的血糖波动幅度，争取平稳降糖，以免加重DR病情进展。

2 波动性高糖引发DR的发病机制

2.1 波动性高糖与细胞凋亡 细胞凋亡又被称为Ⅰ型程序性细胞死亡，其典型的形态学特点是DNA碎片化、染色质凝聚、核固缩、胞质皱缩、胞膜空泡化、凋亡小体形成。覆盖视网膜毛细血管的周细胞减少是DR中首先出现的病理改变及显著特征，已有研究证实糖尿病视网膜毛细血管周细胞丢失与细胞凋亡密切相关[9]。周细胞最重要的功能是调节血管形成并稳定其功能。对人视网膜细胞体外培养[10]显示，缺乏周细胞的毛细血管仍可有完整的内皮细胞，但微动脉瘤和新增生血管通常缺乏周细胞，提示周细胞的缺失使内皮细胞的增生失去控制，发生非VEGF诱导的新生血管形成。周细胞凋亡还可导致毛细血管通透性改变，视网膜微血管渗漏，继而导致微血管基底膜增厚，管腔窄缩和血流改变，促使DR后期发生视网膜缺血缺氧及新生血管形成，最终发生牵拉性视网膜脱离。Beltramo等[11]的实验显示，离体培养24 h后，波动高糖组周细胞出现明显凋亡现象，恒定高糖组周细胞未发生凋亡，而恒定高糖组在转入波动高糖环境下后在24 h内出现细胞凋亡，且凋亡相关分子Bax含量与DNA断裂程度呈正相关。另外一项周细胞体外培养显示，波动性高糖环境下五种凋亡相关分子包括Fas配体(Fas ligand，FasL)，激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(caspase-8)，细胞凋亡调控蛋白tBid，转录因子p53蛋白 和凋亡前体蛋白Bax含量较恒定高糖条件明显增加，其中FasL增加最为显著，而tBid，p53 和Bax增加幅度较小，但恒定高糖培养下的周细胞只有FasL含量明显增加，提示波动性高糖最有可能通过caspase-8激活途径诱发周细胞凋亡进程[12]。并且有文献表明，大幅波动的血糖也可通过激活细胞内Ca2+依赖的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)介导周细胞凋亡[13]，Wu等[14]的体外实验也证实波动高糖较稳定高糖可更强烈地激活PKC，诱导周细胞凋亡。此外，另有研究发现波动性高糖可下调抗凋亡因子Bcl-2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)前体水平，并上调凋亡前体蛋白Bax的线粒体转位和caspase-3 p17蛋白表达水平，促进微血管内皮细胞的凋亡，并加重视网膜缺血缺氧状态和微血栓形成[15]。

2.2 波动性高糖与细胞自噬 自噬以自噬体形成为特征，其激发的细胞死亡不依赖于caspase的加入，自噬体及其内的成分通过自身的溶酶体系统，在酸性环境和溶酶体酶的作用下被清除。自噬引发的细胞死亡有别于凋亡引发的Ⅰ型程序性细胞死亡，因而称之为Ⅱ型程序性细胞死亡。其中人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)自噬又与DR的发生进展密切相关[16]。RPE位于脉络膜和视网膜神经上皮层之间，是通过紧密连接互相交织的单层细胞，参与加强血-视网膜屏障功能，因此RPE细胞层损伤后，血-视网膜屏障功能障碍，引起视网膜渗出、出血及水肿(糖尿病性黄斑水肿)，血管内大分子物质如纤维蛋白进入细胞外基质中形成纤维蛋白凝胶，允许和支持新生血管和基质细胞的内向生长，诱发DR的发生进展[17]。另有研究表明，细胞自噬失控是糖尿病血管内皮细胞发生失稳态的关键因素，并且参与了糖尿病视网膜新生血管形成，通过抑制自噬可在一定程度上抑制新生血管形成，延缓DR进程[18]。宋建[19]发现对比波动性高糖培养环境下RPE细胞ARPE-19的自噬体数量明显多于恒定高糖组，且前者自噬相关蛋白LC3含量明显增高而自噬中间媒介p62蛋白明显降低，提示波动性高糖条件下RPE细胞自噬行为更为活跃。此外，该研究还发现波动性高糖条件下，RPE细胞内可见大量高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)从细胞核释放到细胞质内，并较恒定高糖组有明显增多，而使用丙酮酸乙酯阻断HMGB1的释放后，ARPE-19细胞内的自噬水平显著降低。而另有研究表明胞质内HMGB1主要通过与抗凋亡蛋白Bcl-2竞争自噬基因Beclin-1上的结合位点，形成HMGB1-Beclin-1复合物，诱导自噬启动[20]。因此这也间接证明血糖波动条件下，ARPE-19细胞的自噬启动，是由HMGB1介导的，并最终诱发了DR的发生进展。

2.3 波动性高糖与氧化应激及视网膜组织DNA损伤 氧化应激被认为是糖尿病微血管并发症的重要发病机制之一。视网膜在糖尿病缺血缺氧条件下，线粒体内呼吸链电子传递受抑制，活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量产生[21]。此外，高血糖及波动又可作为刺激因素进一步引发ROS水平上升[22]，胞内ROS最主要的攻击目标是DNA，其中DNA的断裂最为常见。此外，ROS又可通过下游多元醇通路激活、氨基己糖途径、PKC通路、糖基化终末产物增加导致DR的发生进展[23]。谭芳[24]发现血清丙二醛与餐后血糖波动幅度(postprandial glucose excursion，PPGE)成正相关，提示餐后血糖波动可加剧氧化应激的发生，且DR病人PPGE显著高于未合并糖尿病微血管病变的糖尿病病人，因此推测血糖波动可能通过增强氧化应激诱发DR的发生。而李立琴[25]在对ARPE细胞离体培养发现与恒定性高糖相比，波动性高糖环境下不仅血清丙二醛生成增加，且抗氧化指标超氧化物歧化酶活性及谷胱甘肽含量下降，炎性因子细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)表达量增加，提示波动性高糖可能通过加剧氧化-抗氧化机制的不均衡以及氧化应激下炎症反应导致DR的发生。盖春柳等[26]报告糖尿病大鼠视网膜组织存在 DNA损伤，血糖波动可加重该损伤，并认为血糖波动具有独立于持续高血糖以外的损伤作用。此外，在波动性高糖刺激下，Müller细胞合成诱导型一氧化氮合酶增加[27]，并生成过量的一氧化氮，一氧化氮作为自由基，参与氧化应激，诱导细胞凋亡、引起组织细胞损伤。

2.4 波动性高糖与VEGF VEGF是一种分子量约48 kDa的同型二聚体糖蛋白，其分子家族包括胎盘生长因子、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D，其中VEGF-A又称血管通透因子，Klettner等[28]认为其是DR发生发展的关键因素。人VEGF-A基因可通过选择性剪切产生至少6种主要异构体，其中VEGF165是诱导血管生成、增加通透性和激发炎症反应的主要活化因子[29]。VEGF与受体结合后通过诱导视网膜毛细血管炎症反应，上调视网膜局部ICAM-1并增加白细胞黏附造成视网膜白细胞瘀滞，破坏血-视网膜屏障，增加视网膜局部血管通透性，促进血管内皮细胞穿越基底膜后迁移和增殖，刺激视网膜新生血管形成诱发DR的发生进展[30]。研究发现血清VEGF和血小板源性生长因子-BB含量与平均血糖波动幅度，日内最大血糖波动幅度成正相关。徐丽丽[31]在不同条件下培养RPE72 h后，间断高糖组较恒定高糖组细胞胞体薄，形态不规则，且前者较后者VEGF含量明显增高。Sun等[32]发现在间歇性高糖环境下培养的人视网膜血管内皮细胞(human retinal endothelial cells，HRECs)VEGF基因转录和表达水平及线粒体产生的ROS水平较恒定高糖环境下有明显上升，并且通过使用抗氧化剂锰卟啉或2-噻吩甲酰三氟丙酮阻断ROS的作用，可使VEGF表达下调，推测间歇性高糖可能通过某种机制诱发线粒体产生过量ROS，并进一步通过氧化应激通路激活核因子-κB，最终导致HRECs内VEGF表达上调。此外，人视网膜周细胞也是分泌VEGF的主要细胞之一，而其表达的miR-126分子可通过抑制周细胞表达VEGF负向调控视网膜血管内皮细胞和周细胞的增殖和侵袭能力，从而抑制DR的发生进展[33]。Mazzeo等[34]发现间歇性高糖培养下周细胞表达miR-126较恒定高糖培养环境有明显下调，并导致间歇性高糖环境下周细胞分泌VEGF明显增加，但该研究并未发现两种环境下血小板衍生因子和Ang-2通路发生激活，提示间歇性高糖可能只是通过抑制miR-126，上调VEGF表达诱发DR发生。

3 总结

综上所述，理想的血糖控制不仅要争取血糖水平和HbA1c达标，同时要注意减轻糖尿病病人的血糖波动。波动性高糖可通过启动细胞自噬和细胞凋亡，激活氧化应激，损伤视网膜组织DNA，促进VEGF的释放等多种途径参与DR的发生进展，确切完整的机制尚需进一步研究。