广西眼镜蛇毒细胞毒素-1对人肝星状细胞LX2的选择性抑制作用

王秀男，陶慧娟，陈荣芳，班建东，农 君，廖 明，张学荣

(广西医科大学，广西 南宁 530021)

肝纤维化是肝硬化、肝癌和肝功能衰竭的共同病理基础和必经阶段，特征是肝内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是合成ECM的关键细胞，因此抑制其增殖并诱导其凋亡是抗肝纤维化的关键[1]。细胞毒素(cytotoxin，CTX)是眼镜蛇毒的主要活性成分，生物活性多样，对多种细胞均具有细胞毒性[2]，在抗肿瘤研究中具有广阔的应用前景[3]。本研究以HL7702细胞为对照，探索CTX-1对人肝星状细胞LX2的选择性抑制作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人肝星状细胞株LX2，由广西医科大学病理学教研室馈赠；人正常肝细胞株HL7702，由广西医科大学生化教研室馈赠。

1.1.2主要试剂与仪器 广西眼镜蛇毒冻干粉，由广西医科大学蛇毒研究所提供；DEAE-Sepharose CL-6B填料(美国Pharmacia Biotech公司)；Spehadex G-50填料(GE公司)；Macro-prep High S 预装柱(Bio-Rad公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)；Annexin V-APC/7-AAD凋亡试剂盒(联科生物公司)。KTATMstart层析系统(GE公司)；酶标仪( Biotek公司)；流式细胞仪(BD公司)。

1.2方法

1.2.1眼镜蛇毒CTX-1的分离纯化 称取1 g广西眼镜蛇毒粗毒冻干粉，溶解，离心，过滤上清后，经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化。取活性峰冻干粉，采用SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定,NanoLC-ES-I-MS/MS进行质谱鉴定。

1.2.2CCK-8法检测细胞增殖抑制率 将LX2、HL7702细胞都分为空白组和实验组(CTX-1浓度分别为0.5、1、2 、4、8、16 mg·L-1)，采用CCK-8法检测各组细胞的增殖抑制率。抑制率=[(空白组OD值-实验组OD值)/(空白组OD值-培养基组OD值)]×100%。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 将LX2、HL7702细胞都分为空白组和实验组(CTX-1浓度分别为1、2 、4 mg·L-1)，采用Annexin V-APC/7-AAD双染法检测各组细胞的凋亡情况。

2 结果

2.1CTX-1的分离纯化广西眼镜蛇毒粗毒冻干粉经三步层析，分离所得活性峰经鉴定确定为电泳纯的CTX-1，分子量为9.498 ku。

Tab 1 Effect of CTX-1 on proliferation of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2CTX-1选择性抑制LX2细胞增殖CCK-8结果显示(Tab 1)，CTX-1对两种细胞的增殖有抑制作用，呈剂量依赖性。CTX-1抑制LX2细胞增殖的最低有效浓度为0.5 mg·L-1(P﹤0.05)；抑制HL7702细胞增殖的最低有效浓度为8 mg·L-1(P<0.05)。CTX-1对LX2细胞有明显的抑制作用，其IC50为2.50 mg·L-1，而CTX-1对HL7702抑制作用较弱，IC50达到18.97 mg·L-1，说明CTX-1在抑制细胞增殖方面具有选择性。

2.3CTX-1选择性诱导LX2细胞凋亡流式细胞术结果显示(Tab 2)，CTX-1诱导LX2细胞凋亡的最小浓度为2 mg·L-1(P<0.05)；诱导HL7702细胞凋亡的最小浓度为4 mg·L-1(P<0.05)，说明CTX-1诱导LX2细胞凋亡的作用更强。

Tab 2 Effect of CTX-1 on apoptosis of

*P<0.05vscontrol

3 讨论

本研究利用层析法从广西眼镜蛇毒分离纯化得到电泳纯的CTX-1，证实CTX-1对LX2细胞增殖抑制能力强于HL7702，诱导LX2细胞凋亡的作用也更强，而对HL7702影响较小。以上结果说明，CTX-1具有选择性杀伤LX2细胞的特性。本研究首次探讨CTX-1对LX2细胞的抑制作用，为肝纤维化治疗提供实验依据。