基于宏条码技术对校园足球运动员鞋腔内真菌组成的多样性分析

梁桦 梁竹 张芝元 郑欢 韩燕峰 梁宗琦

1 贵州大学体育学院（贵阳 550025）

2 成都体育学院（成都 610041）

3 贵州大学真菌资源研究所（贵阳 550025）

近些年来，由于城市化加速和体育健身设施的广泛使用，以及肥胖和人口老年化，广谱抗生素、免疫抑制剂、化疗、放疗的应用等原因，由红色毛癣菌Trichophytonrubrum，指/趾间毛癣菌T.interdigitale和絮状表皮癣菌Epidermophyton floccosum引起的普通人群皮肤真菌病上升，各种引起深部感染的机会性真菌病原所致的发病率也增高[1-3]。此外，在青少年学生中皮肤感染的发生及流行，以及一些接触性的体育运动项目及设施真菌病原的存在及扩散也受到了广泛关注[4-6]。Dögen调查了土耳其年龄在16～18岁男女学生参加的15个体育项目的皮肤真菌感染情况，结果表明不少男孩都检查出了皮肤病原真菌，红色毛癣菌Trichophyton rubrum、断发毛癣菌T.tonsurans和指间毛癣菌T.interdigitale[1]。美国在国家层面上曾对100所高中，参与9种体育运动（包括男、女足球）学生的皮肤真菌感染进行流行病学调查，为提高对学校体育卫生工作的认识和采取预防措施提供科学根据[7]。

近几年来，我国青少年校园足球运动有了长足的发展。为了保障校园足球运动持久、安全和健康发展，有少数研究者已关注到了运动员微生物感染的安全问题，但其研究多是针对鞋垫及鞋面鞋材的筛选，以提高对病原菌的抑制作用[8-9]。关于我国校园足球运动员鞋腔内富集真菌物种的多样性及致病性风险则未见报道。

宏条码技术（metabarcoding）是使用通用引物对环境样品或生物混合样品中生物总DNA中一段具有鉴定信息的基因片段进行规模化扩增、高通量测序、获得可操作分类单元（operational Taxonomic Unit，OTU），再通过与公认分类DNA条形码数据库比对，从而快速实现物种鉴定的系统分析技术。此技术已在物种监测、生物多样性分析等生态学领域中得到很好的应用[10-11]。应用这种方法分析校园足球队运动员鞋腔内真菌群落组成情况，有利于揭示足球鞋鞋腔内真菌群落组成的多样性，以及可能存在的人类潜在真菌病原，为改善校园足球运动的卫生教育和管理提供科学依据。

1 研究对象与方法

1.1 样本的采集

为观察了解不同地区和不同年龄段青少年校园足球队运动员足球鞋鞋腔内存在的真菌物种多样性及卫生风险性上的差异，我们分别选取贵州省黔北地区某县的2所中学，黔中地区的1所中学和贵阳地区1所大学的校园足球队队员，对其鞋腔进行采样。球队代码分别是：

Qc:对照组：黔北某县A、B两中学未参加校园足球队的一般学生，每校采样15人。

Q1：黔北某县A中学校园足球队（以下简称Q1队）。队员年龄为16～18岁，高中生，21人，足球训练时间2～3年，每周2～3次，每次一般在1.5个小时左右。采样地区为亚热带湿润季风气候，年平均气温为13.1～13.5℃，年平均相对湿度为85%。

Q2：黔北某县B中学校园足球队。年龄及训练时间与Q1队基本相同，15人。

Q3：黔中地区某中学的14～16岁初中生和17～19岁高中生组成的混合样（30人）。这些学生训练时间都在5年以上，每周5次左右，每次训练时间不少于1.5个小时，现为校队主力队员。

Q4:贵阳地区某大学足球专选班学生（24人），平均年龄20岁，每周专选课3次，每次2小时，此外平时还参加课外踢球2次左右。采样地区年平均气温为15.3°C，年平均相对湿度为78%。

采样方法：用无菌水将医用脱脂棉棒湿润，擦洗被选球队队员及对照组学生球鞋鞋腔前部数次。将获得的取样棉棒分别装入无菌的塑料袋中，每支校园足球队及对照组分别装袋。取样袋带回实验室后，无菌操作剥离出采样的脱脂棉，剪碎混合成混合样，4°C冰箱保存，送检。

1.2 样品总DNA提取

使用常用于土壤中总DNA提取的试剂盒（FastDNA®SPIN Kit for Soil），按说明书操作程序进行真菌菌丝体裂解、裂解液均质化及蛋白质增溶、总DNA的纯化。不同样品纯化后的DNA浓度经琼脂糖凝胶电泳检测，其检测参数为：浓度1%，电压5 v/cm，时间30 min。

1.3 PCR扩增及测序

PCR试验采用TaKaRa rTaq DNA 多聚酶，20 μl反应体系：10×Buffer 2 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，正向 引 物ITS1F，CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA（5 μM）0.8 μl，反向引物2043R，GCTGCGTTC TTCATCGATGC（5 μM） 0.8 μl，rTaq 多聚酶 0.2 μl，BSA 0.2 μl，模板DNA 10 ng，而后补ddH2O至20 μl。PCR仪：ABI GeneAmp®9700型。PCR反应参数：a.1×（3 mins，95°C）；b.35×（30 s，95°C；30 s 55°C；45 s 72°C）；c.10 mins 72°C，10°C保存备用。

PCR产物经上海美吉生物医药科技有限公司（www.majorbio.com），Illumina Hiseq平台进行高通量测序，而后进行数据处理和生物多样性分析[12]。

1.4 数据处理

1.4.1 原始数据处理

经Miseq测序得到的双端序列数据，根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，同时对reads的质量和拼接效果进行质控过滤，再根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到的有效序列，并校正序列方向。全部原始序列数据经过滤处理优化，然后去除嵌合体序列后，进行OTU聚类分析，其代表序列作分类学分析。

1.4.2OTU聚类及注释

用Qiime平台（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）将序列按相似度0.97的序列聚类为OTU，选取每个OTU最长的序列作为代表序列。将ITS-rDNA基因的OTU代表序列与Unite（Release 7.0 http://unite.ut.ee/index.php）真菌数据库进行比对，获得每个OTU的分类学信息。基于taxsummarya文件夹中的数据表，利用R语言工具，或在EXCEL中绘制不同水平上的物种组成百分比堆积图及Venn图。

1.4.3 α 多样性分析

用 mothur version v.1.30.1（http://www.mothur.org/wiki/SchlossSOP#Alphadiversity）指数分析程序包对各样本的Shannor-Wiener和Simpson多样性指数进行计算。

1.4.4 聚类分析

根据物种列表，使用R软件R-3.0.3 for Windows程序包，将属-水平上的分类信息进行聚类分析并绘制Heatmap图。

2 结果与分析

2.1 不同校园足球队员与非队员间运动鞋内真菌数量的差异

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：Q1和Q2两支球队总DNA浓度分别为17.8 ng/μg和10.4ng/μg，而对照组Qc仅分别为7.1 ng/μg和2.9 ng/μg，在电泳图中不能清楚显示（图1），表明对照组Qc鞋腔内存在的真菌DNA量很低，以致不能做后续分析。Q1至Q4四支球队则共获得了有效序列133302条，它们分别的序列数及相对丰度表明4支校园足球队球鞋内存在真菌物种的多样性（图2）。

图1 校园足球队与对照组鞋腔真菌总DNA电泳图

图2 不同足球队鞋腔内真菌总序列数及其百分数

2.2 不同校园足球队鞋腔内真菌群落组成的差异分析

从4个校园足球队队员球鞋鞋腔内共获得子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和类原生动物门（Rozellomycota）的12纲，16目，28科，40属。在目的水平上可归类为10群（相对丰度较低的目归入other之中）（图3）。Q1、Q2、Q3和Q4四支校园足球队中这些类群的组成及相对丰度差异明显。在Q4大学生球队中，丝孢酵母目Trichosporonales是优势类群，相对丰度在95%以上。此目中的丝孢酵母属Trichosporon广泛分布于自然界，虽有的成员能通过累积油脂而净化环境，但有的成员侵袭人类[13-14]。而Q3足球队的第一优势类群则是锁掷酵母目Sporidiobolales。已知此目内的一些成员，如赭色掷孢酵母Sporobolomyces salmonicolor能引起皮肤感染、眼内炎、哮喘、过敏性肺泡炎和鼻炎等多种疾病（https://en.wikipedia.org/wiki/）。次优势类群银耳纲的囊担菌目Cystobasidiales，也包含有人类的机会病原，一些隐球酵母Cryptococcusspp.也包含在此目中。随后的优势类群依次是银耳目和酵母菌目。在Q3球队中丝孢酵母目所占比例很低。在球队Q1和Q2中，酵母菌目占主要优势，相对丰度分别达到约83%和28.5%，随后的优势类群目在两个队中明显有别，前者是座囊菌纲Dothideomycetes中一个未定目和散囊菌目Eurotiales，其相对丰度分别为23%和20%，而后者的优势目则分别是座囊菌纲中一个未定目和丝孢酵母目，但相对丰度均未达到5%。可见，四所学校足球队员鞋腔内真菌物种在目水平上组成的多样性有明显差异。Q4大学生球队鞋腔内的优势类群单一。

图3 不同球队队员鞋腔内真菌在目水平上的群落组成及其相对丰度

各球队在属的水平上，真菌的组成和相对丰度上均表现出明显差异（图4）。黔北地区的两个中学校园足球队鞋腔内真菌组成，相对丰度＞1%的都有6个属，但两队的优势类群则明显不同。Q1队的优势属依次是迈耶尔霉Meyerozyma、一个座囊菌纲的未定属、曲霉属Aspergillus、交链孢属Alternaria、隐球酵母属Cryptococcus和丝孢酵母属Trichsporon。Q2队的真菌组成与Q1队一致，但优势属迈耶尔霉Meyerozyma的相对丰度却高达81.82%，其它的属相对丰度较接近，均未达到10%。黔中地区混合队Q3在属水平上的真菌组成，占优势的为红酵母属Rhodotorula、谷氏酵母属Guehomyces、隐球酵母，其它相对丰度较低的还有银耳目Tremellales中的一个属和迈耶尔酵母属。这些分属于各球队中的真菌大多数能引起人类的疾病[15-17]。大学生球队Q4的真菌组成较单一，其最显著的优势属是丝孢酵母属Trichsporon，相对丰度高达97.1%。这个属的一些成员近年被报道存在于人类的微生物组（microbiome）中，能从粪便、健康皮肤和过敏性皮炎患者中分离到，它们所引起的皮肤病的发病率显著上升[13]。Q4球队的第二优势属也是与人类皮肤感染有关的迈耶尔属[14，16]。大学生足球队成员罹患足部癣菌病的风险明显。

图4 不同球队队员鞋腔内真菌在属水平上的群落组成及其相对丰度

2.3 各校园足球队鞋腔内真菌群落的α 多样性分析

α多样性分析能展示群落或样本中物种的多样性，其涵义一是物种的数目和丰富度，二是种的均匀度，即全部物种个体数的分配状况。Shannon和Simpson是两个描述多样性的常用指数。Shannon指数越高说明生物多样性越丰富，而Simpson指数越高则侧重表明群落中物种个体数的均匀度越差。图5显示，混合组建的Q3球队生物多样性最丰富，Q1球队次之，大学生球队Q4的物种多样性最低。球队Q4的Simpson指数最高，说明其群落的组成单一，均匀度差。球队Q2次之，球队Q1和Q3的Simpson指数相近。

图5 不同校园足球队鞋腔内真菌群落的α多样性差异

2.4 各校园足球队球鞋腔内真菌群落组成的Venn图分析

Venn图可用于展现各球队共有和独有的物种数目，直观显示物种组成相似性及重叠情况。四支校园足球队鞋腔内真菌组成的Venn图结构显示，在属的水平上它们自身特有的类群有相当差异（图6）。他们有6个共有属（图7）：分别是迈耶尔属Meyerozyma（相对丰度40.07%），丝孢酵母属Trichosporon（29.48%），红酵母属Rhodotorula（11.75%），座囊菌纲Dothideomycetes中一未定属（10.93%），隐球酵母属Cryptococcus（6.53%），小大卫霉科Davidiellaceae中一未定属（1.42%）。这些共有属中的多数成员也都是人类的病原真菌[13，18]。

图6 不同球队球鞋内真菌群落的Venn图

图7 不同球队球鞋内共有真菌属在属水平上的相对丰度

各球队的特有种各不相同。Q1和Q2足球队的特有属较少，多是来自土壤和植物，仅布勒担孢酵母属

Bulleromyces可能与人类感染有关。Q3和Q4的特有种多数也是土壤与植物内生真菌，其中的红酵母属Rhodosporidium和马拉色菌目Malasseziales中的一些成员对人类有潜在的感染风险[19]。

2.5 各校园足球队球鞋鞋腔内真菌群落组成的相似性

Heatmap图可对球队鞋腔内物种组成进行相似性比较。从图8可看出，球队Q1和Q2首先聚类，显示了它们明显的相似性，而后它们再与球队Q3相聚，最后是球队Q4。Heatmap图表明，在真菌属的水平上，大学生年龄段球队（Q4）与其它3个中学生年龄段球队（Q1，Q2和Q3）间真菌群落组成的相似性较低，具有明显的差异性。

图8 不同校园足球队球鞋腔内属水平上的Heatm ap图

3 讨论

足球运动是一项竞技性和运动量较大的体育活动。在活动过程中，运动者的脚掌在足球鞋腔内能分泌大量汗液，这为真菌的生长不仅提供了营养物质，同时也创造了适宜生长的湿度条件。我们的调查研究已发现，在未参加校园足球运动的对照组学生中，他们的鞋腔内真菌的DNA极少，而被测试的几支校园足球队的队员鞋腔内则能提取相当量的真菌总DNA及序列数。进一步的深入分析显示，这些来自不同地区和年龄段的青少年校园足球队员的鞋腔内，其真菌群落组成多样，且相对丰度也各不相同。

特别值得关注的是，Venn图分析显示，全部4个被检测球队的鞋腔内的共有物种中，皆存在一些人类潜在的病原真菌。人类致病真菌通常可分为浅部真菌和深部真菌。前者多侵染皮肤、毛发等表浅部位，全世界有20%～25%的人群深受其苦[2]；后者侵犯皮下组织、内脏器官等，可经血液、淋巴传播引起播散性真菌感染[17，20]。浅部致病真菌最常见的有：（1）毛癣菌属Trichophyton。如与人类的头癣、甲癣和皮肤癣有关的红色毛癣菌T.rubrum，它是全球最常见皮肤真菌病的病原。断发毛癣菌T.tonsurans则在竞技运动员中引起头癣和体癣[1，19]。（2）小孢子菌属Microsporum。如犬小孢子菌M.canis和石膏样小孢子菌M.gypseum，它们常与人类的皮肤和毛发感染有关。（3）皮癣菌属Epidermophyton。如能引起股癣、足癣、体癣和甲癣的絮状皮癣菌E.floccosum[1-2]。我们的分析揭示了4支校园足球队球鞋鞋腔内共存的6属真菌与上述常见的浅部致病性真菌不完全相同。它们在鞋腔内的丰度依次是，迈耶氏酵母属Meyerozyma＞丝孢酵母属（毛孢子菌）Trichosporon＞红酵母菌属Rhodotorula＞座囊菌纲Dothideomycetes中一未定属＞隐球酵母属Cryptococcus＞和大卫霉科Davidiellaceae中一未定属。其中，迈耶氏酵母属Meyerozyma近些年在临床上被分离出的几率明显增加。它造成的浅部感染可出现脓包、肉芽肿和甲真菌病；深部感染可侵袭有基础性疾病的易感者内脏[16，21，22]。长期以来，丝孢酵母属Trichosporon常被误认为是污染菌。事实上，人类浅表感染病原的10%～40%可能是由此菌所引起，其实它们是人类微生物组的成员之一[13，22]。研究发现，座囊菌纲Dothideomycetes中的一些属，如Cladophialophora，Ochroconis和香港霉属Hongkongmyces的成员，红酵母、隐球酵母也都是能感染人类和动物的机会病原。它们能引起浅表感染、过敏性肺炎和侵入性疾病等[13，18，23]。这些在球队运动员鞋腔内隐藏的潜在病原真菌，对运动者所造成的运动安全风险和公共卫生风险值得关注。

皮肤真菌病原菌可通过两种途径感染和传播：其一，通过人与人或与动物、土壤直接接触；其二，间接地通过媒介，如被污染的设施、设备（如泳池、摔跤垫、体操床垫，足球鞋等）接触被感染[2，5，24]。研究已发现，不同年龄段的个体对病原感染的敏感性不完全相同，在31～60岁的成人脚癣中皮肤真菌的检出率最高，小孩很少发病；男士通常比女士发病高；矿工、士兵以及摔跤和柔道、马拉松、及足球运动员发病检出率高于普通人群。在地区差别上，市区比郊区高，基于全球的尺度上，在亚洲和美国须癣毛癣菌T.mentagrophytes是引起脚癣和灰指甲的最常见病原，但在非洲却很少发现[2，5，25]。我们的研究观察到，黔中中心城市的Q3球队，鞋腔内真菌物种的多样性明显高于黔北某县城的2个球队。Heatmap图的进一步比较分析表明，黔北地区的Q1和Q2两支球队的相似性大于黔中地区的Q3足球队。这在一定程度上也显示了地域的差异。Heatmap图也展示了大学生年龄段的Q4足球队与黔北地区以及黔中地区的中学生年龄段足球队的相似性小，其差异性更明显。Nenoff等研究报道[19]，水解酶和角蛋白酶是红色毛癣菌的主要毒力因子。黔中地区Q4大学生球队成员鞋腔内丝孢酵母Trichosporon相对丰度高达97.1%，其原因可能与这些队员年龄比中学生大，脚部的角质化程度相对高，进而有选择性地富集了嗜角蛋白类真菌，从而提高了人体微生物组中丝孢酵母成员的相对丰度[13，26]。

本研究基于高通量测序及生物信息学云平台分析，揭示了校园足球队队员球鞋腔内真菌群落组成的多样性较丰富，且其中不少是可感染人体的潜在真菌病原。这些研究结果将有助于监测青少年校园足球队队员及相关人群中可能发生的真菌感染及扩散，为支持和推动我国校园足球运动持续、健康发展，为有关主管部门和学校在进行卫生安全教育、管理及制定控制真菌性疾病感染、传播的措施方面提供了科学依据。