miRNA及LncRNA在器官移植免疫排斥中作用的研究进展

沈云志 王毅军

摘要：器官移植是临床上治疗终末期器官衰竭的主要手段，关于器官移植免疫排斥的理论研究目前也非常深入和广泛，但是对于移植术后出现的急性和慢性排斥反应仍然没有得到有效的控制。近年来，非编码RNA（ncRNA）在免疫学中的作用成为人们研究的焦点，它是一类不具有编码蛋白质功能的单链RNA，其中包含两种目前研究最热的ncRNA，即miRNA和lncRNA。大量研究表明，这两种ncRNA在免疫系统的功能方面起着重要的调控作用，以其为基础的基因诊断和治疗在控制器官移植免疫排斥中有着十分重大的前景和意义。本文总结了关于miRNA和lncRNA在免疫学和器官移植免疫排斥中的作用，以期实现对器官移植免疫排斥反应的理想控制和移植物的长期存活。

关键词：器官移植;免疫排斥;非编码RNA

中图分类号：R392.4                                  文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.015

文章编号：1006-1959（2019）02-0043-05

近年来，器官移植已经成为治疗终末期器官衰竭的标准疗法。最初的问题和并发症主要包括移植器官的急性排斥反应，由于免疫抑制疗法的发展而逐渐减少。尽管实现移植物长期存活的治疗方案已经改善，但是急性和慢性排斥反应仍然是威胁移植物存活的主要因素。目前临床上急性排斥反应的发生率已经降低，但移植物的5年以上存活率仍不理想[1]。现阶段临床上应用免疫抑制剂来控制排斥反应以及同时防止受者因使用免疫抑制剂引起的严重感染仍是一项艰巨的任务。为了防止出现移植器官的急性排斥，受者的术后监测至关重要，而目前在临床上主要通过检测患者术后血液中的一些指标，比如在肾移植术后每日检测血肌酐和尿素氮等。这些指标的突然变化常常预示急性排斥反应的发生，但是需要进一步的组织活检等有创手段来证实。基于当前检测手段的弊端，许多研究小组一直致力于建立更灵敏的检测手段证实急性免疫排斥的发生[2-5]。例如，对排斥反应各阶段的基因表达模式的变化进行检测;对受体术后血细胞中某些基因的mRNA表达水平进行检测，如Fas配体;对其他一些免疫相关标志物，如IL-17、组织相容性复合体Ⅰ类链相关分子A或netrin-1进行检测;对特异性趋化因子和受体基因的表达进行检测，如IP-10、MIG和CCR5等进行检测。然而，这些方法仍存在较大的局限性，目前仍然需要寻找更好的器官排斥诊断和预后的标志物。非编码RNA成为当下研究的热点，它是一类不具有编码蛋白质功能的单链RNA，按其长度不同可以分为两大类，一类是长度超过50个碱基的RNA家族，包括长链非编码RNA（lncRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA）、环状RNA（circRNA）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）等;另一类是长度小于50 个碱基的RNA 家族，包括微小RNA（miRNA）、小干扰（siRNA）和PIWI 相互作用RNA（piRNA）等，目前大部分研究人员都将目光聚焦在miRNA 和lncRNA 这两类分子上。

1 miRNA与移植免疫

随着对miRNA研究的不断广泛和深入，研究人员发现miRNA在器官移植免疫排斥过程中起着十分重要的调控作用，这预示着以miRNA为基础的基因诊断和治疗在控制器官移植免疫排斥中有着十分重大的前景和意义。

1.1 miRNA概述  miRNA是一种大小约21～23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。尽管到目前为止对于miRNA与免疫功能关系的认识仍然处于起步阶段，但是对它们的深入研究正逐步改变我们对于免疫系统的发生发展以及免疫功能的调控方面的认识[6]。研究发现，miRNA在淋巴细胞的生成、发育与免疫功能过程中发挥重要作用。Chen CZ等[7]通过构建miRNA文库的方法，发现在造血干细胞中过表达 miR-181a后，B细胞的数量显著上升，推测miR-181a主要调节淋巴细胞，特别是B淋巴细胞的分化;在动物模型中，过表达miR-181a后还能减少T淋巴细胞的数量，尤其是CD8+ T细胞;此外，miR-181a还通过调节T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）的敏感性，从而在T细胞发育成熟过程中发挥调控作用。miR-150是另一个与T细胞、B细胞发育成熟相关的miRNA。研究发现，在造血干细胞中过表达miR-150后，成熟B细胞的数量会显著下降[8]。miR-16在单核、中性粒细胞和CD8+ T、CD4+ T等多数细胞和组织中高表达，推测其在调控细胞周期上具有重要的作用。近期研究发现，miR-16能快速降解在3′非翻譯区含有丰富AU的调控元件，包括TNF-α、IL-8、IL-6等，推测miR-16可抑制过度的炎性反应[9]。这些研究揭示，miRNA在免疫调节和炎症反应中均发挥重要作用。

1.2 miRNA在器官移植免疫排斥中的作用  有研究曾应用受体尿和外周血的某些mRNA表达谱来监测肾移植术后急性排斥反应的发生[10]。这表明不同的mRNA表达能够作为一种无创的检测手段来预测移植免疫排斥的状态。进一步研究证据也提示，与上述mRNA类似，miRNA的表达谱也可以预测同种异体移植物的免疫排斥状态。Nankivell BJ通过对肾移植术后进行活检并分析miRNA的表达水平，结果发现与正常对照组相比，急性排斥反应组中的肾组织标本共有365种miRNA表达水平出现显著性差异[11]。这项研究表明不同表达水平的miRNA能够区分急性免疫排斥组织和健康组织，急性排斥反应和肾功能的变化能够通过高精度检测移植物中的miRNA表达水平来证实。另有研究发现，在急性排斥患者中，外周血及单个核细胞中的某些miRNA，如miR-142-5p，miR155和miR223，出现高表达。在供体器官内，miR146a/b的表达水平在急性排斥反应发生时较对照组显著升高，而这种miRNA在Th1细胞中特异性相关，这同样也证实了单一的miRNA能够作为急性排斥反应的生物标志物[12]。另外，Van Caster P等发现急性排斥反应发生时，miR223在T细胞、B细胞和单核细胞中高表达[13]。在肾移植术后急性排斥反应过程中，肾组织中NKCK-2 mRNA的表达与miR-30-3P和miR-10存在相关性，而且这两种miRNA的表达水平的改变能够影响移植肾实质细胞中免疫细胞的浸润。Sarkar RS等应用微阵列技术和RT-PCR技术分析并确认了急性排斥反应的肾脏组织中差异性表达的71种miRNA，其中12种miRNA表达上调，例如miR-324-3p和miR-611;8种miRNA表达下调，包括miR-125a和miR-31。这些结果表明miRNA可以用来作为急性移植排斥反应中的生物标志物[14]。

另外，缺血再灌注损伤与供体器官的功能密切相关，严重者能够导致器官功能障碍和增加受体的死亡率。因此，除了观察急性排斥反应外，研究人员还研究了移植器官缺血再灌注损伤过程中的miRNA的表达变化。在小鼠肾移植模型中，Godwin JG等分析了肾移植术后缺血再灌注损伤过程中miRNA的表达谱的变化，发现在热缺血再灌注损伤中有9种miRNA的表达水平较对照组有显著差异[15]。

总之，miRNA作为一种有效的生物标志物来监测器官移植术后急性排斥反应的发生，具有非常高的可行性。但是，对于不同来源的器官移植以及如何来精准检测还需要研究人员和临床医生进一步的分析和探讨。

2 LncRNA与移植免疫

随着RNA芯片、RNA 测序等技术的发展，lncRNA在细胞生物学活动中的调控作用逐渐成为研究的热点，它的异常表达与人类很多疾病如肿瘤、免疫系统疾病、器官移植免疫排斥的发生、发展及预后存在密切的联系。

2.1 LncRNA概述  LncRNA的定义是长度大于200个核苷酸的非蛋白质编码RNA。大规模转录组研究揭示了蛋白质编码基因的转录过程包括lncRNA。最新的研究发现在细胞生理过程中能够调控多种基因的表达。虽然研究人员已经在几乎所有的免疫细胞中发现了lncRNA，但其功能目前仍不清楚[16]。某些研究人员已经证实lncRNA能够在初始免疫细胞中诱导出现，而且在免疫调控过程中发挥着重要的作用[17-20]。深入研究lncRNA在免疫应答中的调控机制能够帮助临床上更好的治疗免疫相关疾病。

根据LncRNA在基因上所处位置的不同将其分为多个亚类，如基因间lncRNA、正义lncRNA、反义lncRNA、内含子lncRNA、增强子lncRNA等[21，22]。虽然lncRNA在功能上与mRNA不同，但是lncRNA和mRNA的产生过程却非常相似。大多数lncRNA大部分lncRNA同样由RNA聚合酶Ⅱ催化转录而来，但其序列保守性不高且表达丰度较低，在组织和细胞中表现出较强的特异性[23]。lncRNA通过核苷酸碱基配对或通过RNA折叠形成的结构域来与DNA，其他RNA和蛋白质相互作用。这些特性赋予lncRNA多种功能以调节基因转录。尽管目前已了解的lncRNA数量众多，而且各自作用于不同的效应蛋白，但是归结起来有四种作用机制[24-29]：①lncRNA能够通过充当信号分子来发挥作用。在特定的免疫环境和刺激条件下，lncRNA在某些细胞和组织中呈现特异性表达，这表明lncRNA能作为信号分子来参与转录过程;②lncRNA通过竞争性结合其靶基因来负性调控基因转录过程;③lncRNA能直接结合与其靶效应蛋白来调控核糖核蛋白复杂序列的特定位点;④lncRNA通过将多种效应蛋白或复合物的亚基结合在一起来调控下游的功能蛋白的活性。

在正常体内环境中，许多lncRNA在所有的组织细胞内呈基础表达水平来参与维持细胞功能[30]。许多lncRNA被证实参与多条免疫应答信号通路，其表达水平在不同的免疫环境下而有所不同。例如，lncRNA在在病毒感染的细胞[31]和TLR4或TLR2配体刺激下的树突细胞或巨噬细胞中[19，20]的表达水平发生改变。lincRNA-Cox2，AS-IL1和PACER的表达水平在LPS刺激下的巨噬细胞中通过NF-κB信号通路上调[32，33]。类似地，LP刺激下，IL1β-eRNA，IL1β-RBT46和lnc13在人单核细胞和巨噬细胞中也通过NF-κB信号通路被诱导表达[34，35]。NF-κB相关性lncRNA（NKILA）在IL-1β和TNF-α刺激下被诱导表达[36]，与之相反的是，lincRNA-EPS在LPS刺激下下调表达[37]。总之，在不同的刺激环境中，lncRNA的表达水平发生了变化，并且可能以分子信号身份在不同的免疫应答过程中发挥着重要的调控作用。

许多lncRNA可以通过多种方式来增强炎症免疫应答，例如增加促炎细胞因子或相关炎症靶基因的转录及表达，或增强某些相关炎症信号通路。THRIL是TLR2激活后被誘导表达的lncRNA之一，敲除炎症细胞中THRIL的表达能够抑制TNF-α的分泌[38]。在单核细胞增生李斯特氏菌的感染和TLR1-4刺激条件下，AS-IL-1α通过NF-κB信号传导上调其表达[33]。而AS-IL-1α是IL-1的诱导表达所需的。抑制AS-IL-1α的表达能够降低H3K9的乙酰化水平并减少RNA聚合酶Ⅱ与转录起始位点的结合，这表明AS-IL-1α能够特异性的调节TLR4激活后的IL-1α的表达。此外，某些eRNA，例如IL1β-eRNA和IL1β-RBT46由于是从增强子区域转录而来的，在LPS刺激TLR4条件下在细胞核内通过NF-κB信号通路诱导产生。在免疫活化细胞中特异性的将两者共同敲除能够抑制炎症因子IL-1β和CXCL8的表达[39]。相对应的，另外一些lncRNA被证实能够通过多种方式来抑制免疫应答反应，比如通过抑制炎症因子的表达，或抑制相关炎症信号通路。例如，LPS刺激条件下lincRNA-EPS在巨噬细胞中表达下调[37]。lincRNA-EPS缺陷型小鼠在接受LPS刺激时能产生较高水平的炎症因子和发生更高水平的LPS诱导致死率。另外一种抑制免疫应答的重要LncRNA是Lethe，在免疫细胞内敲除其表达能够上调NF-κB信号通路相关靶基因的表达，其机制是Lethe能够通过直接结合p65同源二聚体而抑制p65与相关靶基因的结合。同样的，lincRNA-NKILA也被研究人员证实能够抑制炎症相关信号通路[35]。

2.2 LncRNA在器官移植免疫排斥中的作用  尽管目前lncRNA在免疫系统中的作用已有较深入的认识，但是对于lncRNA 在器官移植免疫排斥中作用的研究却刚刚起步。Chen W等[40]在其研究中通过基因芯片技术分析肾移植术后出现急性排斥反应时肾组织中lncRNA的表达情况，发现与对照组相比，急性排斥反应发生后某些lncRNA出现差异性表达，而进一步对其进行生物信息学分析发现这些lncRNA与移植后免疫激活和炎症密切相关。其中一种重要的lncRNA-ATB在肾移植后急性排斥受体肾组织切片中明显高表达，进一步研究发现高表达的lncRNA-ATB可通过竞争性结合miR-200c而促进供体器官的炎症反应[41]。还有研究发现lncRNA-ATB与免疫抑制剂对肾组织的毒性存在相关性，环孢素（CsA）介导的细胞凋亡作用在过表达ATB的肾细胞中显著增强。Gu G等[42]在其研究中对肾移植术后患者的尿液标本进行lncRNA的检测，结果发现了一种显著差异性表达的lncRNA-RP11，该lncRNA在出现急性排斥反应患者的尿液中的表达明显升高，但是在经过免疫抑制控制急性排斥反应后，其表达水平逐渐恢复正常。后续生物信息学研究表明这种lncRNA与炎症表达密切相关。这同样表明lncRNA与器官移植免疫排斥过程密切相关，但其具体机制有待进一步研究。还有研究人员[43]在小鼠同种异体心脏移植模型中发现两种lncRNA（A930015D03Rik和lincRNA1055）与同系对照组相比，在供心中表达显著上调，进一步生物信息学分析发现两者与免疫排斥过程中Th1细胞的活化密切相关。进一步在人类基因组中筛选出与两者匹配度最高的lncRNA，发现其在肾移植术后发生急性排斥反应后肾组织中的表达高于对照组。以上研究说明特定lncRNA有可能成为新的标志物，用来早期诊断或预测移植术后急性排斥反应。

綜上所述，作为非编码RNA的重要分子，miRNA及LncRNA在器官移植免疫排斥中起着重要的调控作用。针对两者在免疫排斥中的特异性表达变化，能够帮助我们寻找新的免疫排斥标志物以及进一步深入研究器官移植免疫排斥的机制。

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收稿日期：2018-11-11;修回日期：2018-11-20

編辑/杨倩