HBV相关肝纤维化中Klotho蛋白的表达及临床意义*

聂 芳，黄 蝶，黄琪芸，许 颖Δ

1.成都医学院第一附属医院 检验科 (成都 610500)；2.成都医学院 检验医学院(成都 610500)

肝纤维化是乙型肝炎病毒(HBV)引起的慢性乙肝发展成肝硬化的中间过程，是多种肝病所共有的组织学改变，炎症是慢性肝病的基本病变，所有肝脏损伤修复都必然经历炎症、肝纤维化这一过程。肝纤维化是由各种致病因素所致的肝内细胞外基质(ECM) 包括胶原、非胶原糖蛋白、蛋白多糖过度沉积的病理过程，是一系列损伤因子作用后引起的一种可逆性性损伤后修复的过程[1]。肝纤维化以及肝硬化早期在通过适当的临床干预后其实能够逆转，早期发现确诊并进行有效的治疗以阻断肝纤维化的发生和发展，使其降解、逆转，对预防肝硬化具有重要意义。

Klotho是新近发现的一种抗衰老基因，其表达产物分为膜结合型和分泌型两种蛋白。在许多抗衰老研究中也已经证实分泌型Klotho蛋白还能够抑制细胞和组织的氧化应激，抑制凋亡。Klotho抑制了CsA诱发的EMT和肾纤维化，发现CsA可以降低Klotho表达，促进肾的纤维化，并激活EMT反应，表现为TGF-β1的增加和α-SMA的表达，E-cadherin表达的减少；Klotho能通过调节肾脏内EMT相关蛋白的表达，明显改善肾脏的病理病变[2]。然而，目前关于Klotho基因与肝纤维化的相关作用机制和临床应用几乎处于空白。本实验从人体血清学水平研究分泌型Klotho在HBV导致肝脏纤维化中的表达及临床意义，阐述Klotho表达水平与乙型肝炎病情严重程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

分别收集2017年2月至2018年2月成都医学院第一附属医院健康体检、收治入院或门诊就诊的符合条件的5组入选人群共319例，其中正常组77例、慢性乙型肝炎组(分为轻、中、重度3组，分别为59例、51例、64例)、肝硬化组68例。所有入选者统一入选标准：年龄在30～88岁，性别不限，排除合并糖尿病、高血压、肝癌、甲状腺疾病、心血管疾病、除HBV外其他病毒感染引起的急慢性肝炎，以及其他原因导致的肝硬化(自身免疫性肝炎、酒精性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、遗传代谢性或药物性肝炎)等。其中健康体检者作为正常组，除统一入选标准外，既往均无乙型肝炎病史或新近发现乙型肝炎；轻度乙肝组入选标准：既往有乙型肝炎病史或新近发现乙型肝炎，6个月内未经抗病毒治疗，HBV DNA小于1 000 IU/mL，ALT在正常值范围内，影像学检查(B超、CT)未见肝脏纤维化改变；中度乙肝组入选标准：既往有乙型肝炎病史或新近发现乙型肝炎，6个月内未经抗病毒治疗，HBV DNA>1 000 IU/mL，ALT在正常值范围内，影像学检查(B超、CT)未见肝脏纤维化改变；重度乙肝组入选标准：既往有乙型肝炎病史或新近发现乙型肝炎，6个月内未经抗病毒治疗，HBV DNA>1 000 IU/mL，6个月内至少2次ALT超过正常值上限的2倍，影像学检查(B超、CT)可见肝脏纤维化改变；肝硬化组均为经肝组织活检所诊断，入选标准：既往有乙型肝炎病史，6个月内未经抗病毒治疗，HBV DNA>1 000 IU/mL，6个月内影像学检查和肝组织活检均诊断为肝硬化。

在进行实验前均取得所有入选者的知情同意，同时通过成都医学院医学伦理委员会(人体实验)伦理审查。留取所有受试者的血液样品，检测相关指标后冻存在-80 ℃冰箱以备后续检测。

1.2 研究方法

在本院检验科抽静脉血6 mL于红色采血管中,离心15 min获得血清，然后将血清分为3份，1份用于检测生化相关指标，1份用于检测肝纤4项中的HA(透明质酸)浓度，最后1份冻存在-80 ℃冰箱用于后续检测Klotho蛋白浓度。采用日立全自动生化分析仪7600检测各组血清中肝功能生化指标：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、胆汁酸(TBA)的浓度；采用荧光定量PCR仪检测血清HBV DNA水平；采用安图公司Autobio A2000plus 全自动化学发光测定仪分析系统检测各组血清中透明质酸(HA)的浓度；采用人Klotho ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，CSB-E13235h)检测各组血清中Klotho蛋白的浓度，操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组肝功能生化指标在各组中的比较

5组在性别、年龄一般资料方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。生化指标结果显示：5组血清中总蛋白(TP)含量，差异无统计学意义(P>0.05)；与正常组相比较，ALT表达量在重度乙肝组中更高(P<0.05)，ALB表达量在中度乙肝组、重度乙肝组和肝硬化组中更低(P<0.05)，AST、GGT、ALP、TBIL、DBIL、TBA表达量在重度乙肝组和肝硬化组中更高，PA表达量在轻度、中度、重度乙肝组和肝硬化组中均较低，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)

表1 各组肝功能生化指标含量的比较

注：与正常组相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 Klotho与肝纤维化指标HA在各组中的表达差异

轻度、中度、重度乙肝组和肝硬化组患者血清中Klotho蛋白表达水平均高于正常组，差异具有统计学意义(F=35.770，P<0.001)；重度乙肝组和肝硬化组患者血清中Klotho蛋白表达水平均高于正常组，差异具有统计学意义(F=40.450，P<0.001)(表2、图1)。

表2 Klotho与肝纤维化指标HA在各组中的表达差异

注：与正常组相比较,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图1 Klotho与肝纤维化指标HA在各组中的表达差异

注：A：5组患者血清中Klotho蛋白表达水平比较，与正常组相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；B： 5组患者血清中HA蛋白表达水平比较，与正常组相比较，**P<0.01，***P<0.001

2.3 Klotho与各项肝功能指标的相关性

Klotho与AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA均成正相关(P<0.05)，与ALB、PA成负相关(P<0.05)，与ALT、GGT、TP均无相关性(P>0.05)(表3)。

2.4 Klotho与肝纤维化指标HA的相关性

Klotho和HA蛋白浓度经过Log Transform处理后进行相关性分析，结果表明在乙型肝炎和肝硬化患者中Klotho和HA成明显的正相关(r=0.782,P<0.05)(图2)。

项目Log(Klotho)rPLog(HA)0.7820.001

图2 Klotho与肝纤维化指标HA的相关性分析

3 讨论

在当今社会肝纤维化是一个预后极差且病死率很高的疾病，严重威胁着人类的健康，常见于多数慢性肝脏疾病中[3]。在发达国家，导致肝脏纤维化的主要原因包括慢性丙型肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝病等。而在发展中国家中，慢性乙型肝炎病毒感染、酗酒是导致肝纤维化的主要因素[4]。因此，肝纤维化也是各种慢性肝脏疾病发展至肝硬化的关键，作为进一步发展肝硬化及肝癌的中间过程，也是肝脏炎症、肝脏肿瘤等许多慢性肝脏疾病的重要中间环节，对探索肝癌等其他疾病的发生有重要的意义。以往研究者[5]认为肝纤维化是不可逆的，但是近年来临床上越来越多的实际病例表明，肝纤维化这种疾病在经过治疗后，可能会继续发展，也可能会逆转。重视肝纤维化的及早治疗，从而使“慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”这条慢性进展过程得以终止。

目前临床上用病理肝穿、B超、CT、MRI、实验室诊断等诊断肝纤维化，血清学指标的高低与肝穿诊断的肝纤维化严重程度密切相关，不如肝穿刺检查来得直接，但对于某一病人来说，往往很难根据一次化验指标高低来确定肝纤维化的程度。血清化验的优点是取材方便、容易复查，如果能定期检查(如每半年或一年)则可以根据这些指标是升高或降低的总趋势来了解肝脏纤维化的发展变化情况，也可大致了解抗纤维化治疗的临床效果。目前肝纤维化和肝硬化无创诊断的血清学模型参数主要是肝纤维化四项血清指标PCIII(III型前胶原)、IV-C(IV型胶原)、LN(层粘连蛋白)、HA(透明质酸酶)，尤其是HA，对判断肝纤维化有较好的相关性，临床诊断价值较高[6]。

Klotho是一种新发现的抗衰老基因，最初人们发现，该基因缺陷小鼠会出现一系列类似人类衰老的表型变化，包括生长阻滞、动脉硬化、骨质疏松、代谢功能紊乱等[7]，其表达产物有膜结合型和分泌型两种蛋白，二者分别是膜结合受体和体液调节因子，能通过如调节维生素D和钙、磷代谢，抗凋亡、保护心血管系统等途径，抗衰老等多种疾病进行调节。分泌型Klotho蛋白在体内可作为一种内分泌激素，能够在血液、尿液、脑脊液中检测到。有研究[8]显示，Klotho蛋白在肾癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤组织中表达水平较低，尤其在肾癌组织中的表达量与肿瘤大小、临床分期成负相关，与病人的生存率成正相关，说明Klotho蛋白可能是一个肿瘤抑制因子，其能抑制肿瘤细胞增殖。Camilli等[9]在对黑色素细胞瘤的研究中发现，Klotho基因表达的上调能够抑制钙蛋白酶，减少细丝蛋白A的裂解，进而改变细胞骨架，能够促进细胞间叶标志物神经钙黏蛋白的下调，并使在细胞间起粘连调节作用的上皮钙黏蛋白表达的上调，促进EMT相关基因表达的下调，在逆转EMT方面发挥重要作用。现今EMT过程在纤维化的发生发展过程中的作用越来越受到重视，EMT可能是肝纤维化另外一条重要机制。因此，本课题旨在研究Klotho在乙肝肝硬化中的表达差异，以及其含量与HA的相关性。

本研究显示，319例临床病例中重度乙肝组和肝硬化组血清HA蛋白均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。而Klotho在轻、中度乙肝组的表达差异具有统计学意义(P<0.05)，在重度慢性HBV相关性肝病尤其是乙肝肝硬化中较正常组表达明显更高。肝纤维化是重度乙型肝炎发展为肝硬化的重要病理过程，这些结果表明Klotho可能成为肝纤维化中一个更为敏感的检测指标，并且提示Klotho可能参与了肝纤维化的病理发病机制。

另外，我们发现Klotho与肝功能指标AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA均成正相关，与ALB、PA成负相关，与ALT、GGT、TP均无相关性，这些结果表明Klotho与肝功能炎症损害密切相关，但是Klotho与肝脏炎症活动的重要指标ALT无相关性，其可能解释是ALT易受降酶药物等诸多因素的影响，且部分肝炎患者在肝脏炎症活动时ALT却不出现明显异常，部分肝硬化患者或肝细胞严重坏死者其ALT水平与肝脏炎症或损伤程度也不成平行关系。

Klotho与肝纤指标HA水平呈正相关性预示着它们可能在肝纤维化中发挥着相同的作用机制。HA的主要作用是参加构成蛋白聚糖多聚体，能够被内皮细胞摄取和降解。如果肝细胞遭到刺激而受伤，处于沉睡状态下的肝星状细胞(HSC)就会转变为活化状态，HA合成和排泌上调，再加上内皮细胞数量相对减少，功能降低致透明质酸降解减少，从而致使透明质酸间接增多[10]。相关研究[11]表明在慢性肝病的发展中，HA在急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化中浓度由低到高。血清HA对肝纤维化的病情改变比其它血清学指标更敏感，是目前反映肝纤维化和肝炎症的所有血清学指标中最敏感的指标，Klotho与HA 的正相关关系预示Klotho可以作为肝纤维化诊断模型一个独立或附加参数，联合肝纤四项形成新的预测模型，使慢性乙型肝炎肝纤维化诊断模型更准确更多样化，对预防肝硬化，指导早期干预具有重要意义。

综上所述，Klotho蛋白可能参与了肝功能炎症损害和肝纤维化的发生发展，为探讨Klotho对肝纤维化的抗炎作用，以及抑制肝纤维化的上皮间充质转化的作用，还需要在后续的动物和细胞实验进一步探究具体的作用机制及分子机制。相关研究在完善肝纤维化的分子调控机制方面具有重要意义。