TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ在特应性皮炎小鼠模型中的表达及意义*

张丽霞，王 倩，赵 蓓，卢 葳，段西凌

四川省医学科学院·四川省人民医院 皮肤性病研究所(成都 610072)

特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)发病机制复杂，其中皮肤屏障功能障碍及多种致病微生物定植是AD患者发病及加重的重要因素。Toll样受体2(TLR2)可识别金黄色葡萄球菌的肽聚糖成分，通过作用于MyD88-NF-κB信号途径在引起天然免疫反应同时触发适应性免疫，诱发AD加重[1]。近年研究[2]表明，胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin ,TSLP)在启动Th2驱动的适应性免疫起总开关和主调节器的作用。本研究团队在前期的课题研究中也给与了证实[3]。有研究[4]称,在体外培养的人角膜上皮细胞中, 外源性致病原与上皮细胞的Toll样受体(toll like receptors ,TLR)结合后，可以诱导上皮细胞中TSLP的表达增加,进而促进趋化因子受体和各种黏附分子的表达增加。这一结果提示,上皮细胞分泌的TLR可通过TSLP的作用,在上皮细胞介导的固有免疫和适应性免疫间起中介作用。IL-4为TH2型细胞分泌，IFN-γ主要由TH1型细胞分泌，为常用的检查TH免疫失衡指标。因此，本研究拟通过检测TLR2、TSLP、IL-4和IFN-γ在AD小鼠模型中的表达，对TLR2、TSLP在AD免疫失衡发病机制中的关系进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂及器材

将32只6～8周SPF级雌性纯系BALB/c小鼠(四川省人民医院实验动物中心)，按照随机数字表法分为对照组和实验组,每组16只。2,4-二硝基氟苯(DNFB)(美国Sigma公司)，小鼠IL-4、IFN-γELISA检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)，小鼠TSLP、TLR2 ELISA检测试剂盒(美国R&D公司)。兔抗鼠TSLP、TLR2多克隆抗体(美国Prosci公司)，免疫组化染色试剂盒(SP-9001) (北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色试剂、0.01M柠檬酸盐缓冲液、PBS缓冲液、多聚赖氨酸(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 AD模型建立方法 参考张丽霞[3]、Wu G等[5]采用的2,4-二硝基氟苯接触致敏法建立AD小鼠模型。

1.2.2 血清TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ浓度检测 小鼠模型建立成功后，摘除右侧眼球取血，常温静置30 min后,以离心转速3 000 r/min，离心半径10 cm，高速离心15 min后，采用ELISA法测定血清TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ浓度。

1.2.3 组织学方法 取小鼠皮损组织，常规固定石蜡包埋、切片，进行免疫组化染色。光镜下，通过Image-proplus6.0软件分析TLR2、TSLP染色阳性细胞的平均灰度。同时做病理切片，观察组织病理改变，确认小鼠AD模型建模成功。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠致敏部位皮损及皮肤病理变化

实验组小鼠皮肤可见典型湿疹样改变：边界不清红斑、丘疹、点状结痂及苔藓样变等。实验组病理切片提示角化过度，程度不同棘层肥厚，细胞水肿，细胞间桥拉长，真皮浅层可见以淋巴细胞为主的慢性炎细胞浸润。实验组皮损及镜下病理表现均符合AD慢性期表现，提示AD小鼠动物模型建模成功。

2.2 小鼠AD动物模型皮损免疫组化结果

TLR2的阳性表达为棕黄色染色，主要位于细胞膜及胞浆，基底层及棘细胞层广泛表达。实验组平均光密度值(136.591±15.621)明显高于对照组(13.542±3.865)(图1), 差异有统计学意义(t= 4.551，P<0.05)。

图1 TLR2在正常小鼠及AD模型组皮损处的免疫组化表达

注：图A,B为正常对照(A×100，B×400)；图C,D为实验组(C×100，D×400)；TLR2的阳性表达为棕黄色染色，主要位于细胞膜及胞浆

TSLP阳性表达也为棕黄色染色，主要位于胞核、胞浆及胞膜少量着色。实验组阳性表达明显高于对照组(图2)。实验组及对照组平均光密度值分别为(74.306±17.898)、(46.093±3.347)，差异有统计学意义(t=15.213，P<0.05)。

图2 TSLP在正常小鼠及AD模型组皮损处的的免疫组化表达

注：图A,B为正常对照(A×100，B×400)；图C,D为实验组(C×100，D×400)；TSLP阳性表达也为棕黄色染色，主要位于胞核、胞浆及胞膜少量着色

2.3 两组AD小鼠血清TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ表达水平比较

AD小鼠血清TLR2(142.896±11.934)、TSLP(213.621±34.666)、IL-4(97.831±15.882)、IFN-γ(70.999±9.604)的表达水平均明显高于对照组血清TLR2(14.302±3.548)、TSLP(151.997±22.328)、IL-4(60.560±9.286)、IFN-γ(51.224±4.534)，差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ在AD动物模型实验组和对照组血清的表达

2.4 实验组TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ血清表达水平的相关性分析

实验组小鼠血清中TLR2表达水平与TSLP、IL-4表达水平呈正相关(R=0.854，R=0.845,P=0.003);TSLP、IL-4表达水平呈正相关(R=0.997,P=0.005),而TSLP、TLR2均与IFN-γ表达水平呈负相关(R=-0.756，R=-0.570，P=0.002)(图3)。

图3 实验组小鼠TLR2、TSLP、IL-4、IFN-γ血清表达水平相关性分析

3 讨论

AD是一种常见的复发性、瘙痒性、炎症性皮肤病,严重影响着患者的生活质量。AD发病机制复杂。其中皮肤屏障功能障碍伴发微生物定植是AD患者发病及加重的重要因素。TLR是识别微生物特别是细菌及其组分的识别受体之一，通过识别微生物病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引起机体对于致病原的免疫应答。Forbes-Blom等[6]研究发现，小鼠皮肤角质形成细胞表面的TLR2能与金黄色葡萄球菌超抗原结合，增强其针对变应原初始暴露产生的Th2型免疫反应，并导致连续变应原暴露后诱导的Th2细胞数量明显增加。被激活后的TLRs通过细胞内的MyD88信号通路,增强炎症细胞的免疫应答作用,同时分泌各种细胞免疫因子,趋化中性粒细胞,巨噬细胞等免疫细胞向感染区域移动,杀灭致病微生物。TSLP就是上皮细胞产生的参与这种信号传导的细胞因子，并促进机体向TH2型适应性免疫分化[7-8]。

TSLP为IL-7的类似物。主要表达在人类的上皮细胞,皮肤角质形成细胞以及支气管平滑肌细胞,主要通过激活树突状细胞(dendritic cells，DC)发挥免疫效应。其主要通过3个途径发挥作用：1)TSLP通过上调效应靶细胞表面TLR及其相关配体,促进DC成熟,提高其抗原提呈能力以及致炎作用[9]。2)TSLP还可以诱导DC表达各种趋化黏附分子,促进DC向感染部位的黏附和归巢。3)TSLP还可以促进初始T细胞成熟，提高其转化为效应T细胞的转化率[10]。因此TSLP被誉为炎症反应的“总开关”。国外研究[11]表明，正常组小鼠上皮细胞TSLP不表达，而在过敏组TSLP表达较正常组明显增加。本研究团队在前期的课题研究[3]中发现，AD小鼠动物模型建立后TSLP在皮损及血清表达水平明显增高。TSLP、IL-4及IgE相关性分析发现，其间存在正相关性，相反TSLP与IFN-γ之间存在负相关性。其中IL-4为TH2型细胞分泌，IFN-γ主要由TH1型细胞分泌，初步证实TSLP参与了AD的进展、持续和慢性化发病机制。

研究[4]报道:在体外培养的人角膜上皮细胞中, 外源性致病原与上皮细胞的TLR结合后，可以诱导上皮细胞中TSLP的表达增加,进而促进趋化因子受体和各种黏附分子的表达增加。这一结果提示我们,上皮细胞分泌的TLR可以通过TSLP的作用,在上皮细胞介导的固有免疫和适应性免疫间起中介作用。

基于以上提示，我们用免疫组化方法及ELISA检测TLR2及TSLP在AD小鼠模型中的表达，结果显示TLR2的阳性表达物质主要位于细胞膜及胞浆，基底层及棘细胞层广泛表达，实验组表达水平明显高于对照组；TSLP阳性表达物质主要位于胞核，胞浆及胞膜少量着色。实验组着色密度明显高于对照组。血清中TLR2及TSLP水平均高于对照组，TLR2表达水平与TSLP呈正相关，且TLR2与IL-4、IFN-γ表达水平相关性与TSLP一致；提示TLR2有可能通过TSLP作用上调TH2型细胞分泌，下调TH1型细胞分泌，引起TH免疫失衡，诱发AD加重。

分析其可能的机理，受外界微生物刺激后，TLR2过度表达,外源性致病原与TLR2胞外段特异性识别,受体胞内段发生变构,从而激活Myd88通路蛋白,通过激活信号转导网络途径,最终激活NF-κB,继而使上皮细胞分泌TSLP增加, TSLP激活后促进DC的成熟诱导效应T细胞的趋化迁移,细胞炎症因子分泌增加,进而引起Th2免疫失衡，诱发致敏，从而在上皮细胞介导的固有免疫和适应性免疫间起中介作用。

综上所述， TLR2有可能通过识别与AD相关的外源性致敏原,诱导上皮细胞分泌TSLP,进而启动Th2的超敏反应。那么我们推测在临床症状控制后，其病理生理低水平维持时间内，TLR2及TSLP表达水平高低有可能决定Th1与Th2平衡是否再次被打破，继而诱发AD复发。因此，TSLP有可能成为预测停药后是否短期复发的有效指标，有待于今后研究进一步证实。