miR-30b在膀胱癌中表达的临床意义及对膀胱癌细胞生物学特性影响研究

李利军，邱明星，马志伟，龚百生

(四川省医学科学院·四川省人民医院泌尿外科，四川 成都 610072)

膀胱癌是最常见的泌尿生殖系统癌症，是影响患者健康及生命安全的恶性疾病，发病率及死亡率均较高。目前临床对于此类疾病主要采用手术切除为主，化疗、放疗等综合治疗为辅，但疗效均不理想[1，2]。寻找膀胱癌的发病基因，从遗传学途径了解膀胱癌的发生机制，是膀胱癌诊疗的基础[3]。MicroRNA是一种内源性的具有调控功能的小分子RNA，通常在转录后表达，研究表明[4，5]，miRNA能够参与癌细胞的各项生物学过程，如增殖、分化、凋亡等，miRNA具有组织特异性、时序性及保守性的特点，因此有学者认为miRNA属于新层次上的基因表达调控，miRNA的表达可能作为肿瘤预后的重要指标。miR-30b是近年来发现在肿瘤细胞中出现异常表达的一类miRNA，研究显示，miR-30b具有一定的抑癌基因功能[6]。但国内对于miR-30b在膀胱癌中的表达尚缺少研究。本文就miR-30b与膀胱癌的相关性，及miR-30b对膀胱癌细胞生物学特性的影响进行了研究分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料2012年7月至2015年9月我院泌尿外科32例膀胱癌手术患者，男21例，女11例，年龄42～76岁[(61.3±4.9)岁]。均行膀胱切除术治疗，病理检验证实为膀胱尿路上皮癌，取标本前均未进行过放化疗或免疫治疗。除取患者的肿瘤组织标本外，同时取距离肿瘤边缘3～5 cm的正常组织作为对照标本，每份标本分别置于液氮罐及福尔马林溶液中进行保存，固定后石蜡包埋送病理诊断。临床分期标准参照国际抗癌联盟2002年的TNM分期法[7]，病理分期标准参照WHO1973分级标准[8]。

1.2方法

1.2.1细胞及试剂来源 膀胱癌细胞T24、5637来自于中南大学湘雅医学院细胞中心，肿瘤系，肿瘤细胞采用10%胎牛血清培养，培养基为DMEM培养基，置于37 ℃培养箱。培养基及胎牛血清由美国GIBCO公司生产，试剂盒由Qiagen公司生产。

1.2.2试验方法 采用实时荧光定量检验。组织和细胞置入700 μlQIAzol混匀，室温5 min；加入140 μl氯仿，震荡摇匀，室温放置2 min后于12000r/min下离心15 min，取上清液，加入500 μl无水乙醇，混匀，10000r/min下离心15 s，去穿流液并再次重复该步骤，洗柱，取BufferRPE500 μl置于室温下10000r/min下离心2 min，转移至1.5 ml收集管，加入RNase-free water 50 μl至内膜，震荡摇匀，置于-70 ℃下保存。依次加入1ug total RNA，1 μl 10×reaction buffer，0.25 μl RiboLock Ribonuclease，0.25 μl Inhibitor，8 μl DEPC-treated water，1 μl DNase I，置于37 ℃下孵育30 min，加入1 μl EDTA并置于65 ℃下孵育10 min，添加至PCR管中，短暂离心混匀，95 ℃预变性5 min，扩增40各Cycling，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。取培养液加入96孔板，每孔100 μl，置于37 ℃条件下培养24 h，加入受试化合物，采用Dilution Buffer稀释1/5，每孔加入50 μl 1×MTT，37 ℃下孵育4 h，吸出上清液，每孔加入150 μl DMSO，摇匀，采用酶标仪测量570 nm波长时的每孔光密度，细胞存活率=(加药细胞OD-本底OD/对照细胞OD-本底OD)×100%。消化细胞，离心，去培养液，PBS洗1～2次，采用BSA无血清培养基重悬，调节密度为5×104ml。加入6孔板，加入1 mlFBS培养基，在Transwell上室加入细胞悬2 ml，常规培养24 h，95%酒精固定20 min，苏木素染色10 min，200×电镜下观察随机5各视野的计数。取1×107个细胞在4 ℃下离心5 min，吸去上清，PBS洗1次，取样品细胞加入裂解液100 μl重悬，冰浴裂解15 min，4 ℃下离心10 min，将上清液转入离心管，取少量样品测定蛋白浓度，绘制caspase-3酶活性标准曲线图。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0进行数据统计。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1miR-30b的表达膀胱癌细胞中的miR-30b表达为(1.096±0.449)，与癌旁组织的(8.617±1.856)比较，显著降低(t=-6.822，P< 0.05)。

2.2临床分期各组中miR-30b的表达本组患者包括II期19例，III～IV期13例，其中miR-30b在II期患者的癌症组织中表达量为(1.092±0.437)，在III～IV期患者中表达量为(1.104±0.456)，差异无统计学意义(P> 0.05)。

2.3病理分期各组中miR-30b的表达本组患者包括中低分化21例，高分化11例，miR-30b在中低分化患者中的表达量为(0.741±0.209)，在高分化患者中的表达量为(1.690±0.479)，差异有统计学意义(t=-3.145，P< 0.05)。

2.4转染效率采用绿色荧光标记6 h，在荧光倒置显微镜下观察细胞胞浆表达情况，评价转染效率。结果显示miR-30b的细胞转染率达到80%以上，证明本次转染能够有效将miR-30b转染于T24肿瘤细胞。见图1、图2。

图1 转染目的miR-30b mimics组转染效率检测

图2 阴性对照组转染效率检测

2.5miR-30b对癌细胞侵袭能力的的影响将Transwell小室置入培养板，用聚碳酸酯膜隔离上下室，将T24肿瘤细胞置入上室，统计进入下室的T24数量，以此来评价癌细胞的侵袭能力。结果显示，转染miR-30b组T24细胞的侵袭数量为(19.43±2.06)，阴性对照组的侵染数量为(45.49±3.56)，差异有统计学意义(t=-10.974，P< 0.05)。

2.6miR-30b对癌细胞凋亡的影响采用标准曲线公式计算各组中的caspase-3酶活性，阴性对照组酶活性为(15.437±1.594)U/mg，转染miR-30b组的酶活性为(46.019±6.004)U/mg，差异有统计学意义(t=-8.527，P< 0.05)。

3 讨论

膀胱癌属于泌尿生殖系统的常见肿瘤，目前尚无特效治疗方案，研究膀胱癌的发病机制，对于预防、治疗膀胱癌均有着重要的意义。既往的研究主要集中在膀胱癌细胞基因的改变上，但目前尚未有突破性进展。目前已知与膀胱癌相关的基因型较多，Derfoul等[9]的研究指出bcl-2的异常表达是导致膀胱癌辐射治疗效果降低的独立因素；Catto等[10]的研究发现膀胱癌中C-myc蛋白的表达与癌细胞的增殖、侵袭能力有显著相关。

miRNA属于一种小型非编码RNA分组，这些小型的RNA实在转录后水平调控基因表达，属于更高层次上的调控。CNS将miNRA的研究进展列为十大科技突破之一，肯定了miRNA在癌细胞机制研究中的意义[11]。肿瘤细胞与正常组织miRNA的表达存在显著差异，且大多数miRNA都处于相对脆弱的基因位点上，这提示miRNA可能在肿瘤的行程中有着重要的作用。Feng等[12]对412个哺乳动物的样本中的miRNA表达谱进行了分析，研究显示miRNA的表达能提供多种有用信息，可以反映出肿瘤的分化状态及发展谱系。Li等[13]对174例膀胱癌患者组织标本和52例正常膀胱标本进行了miRNA检测，结果发现若干表达差异的miRNA，其中miR-145下调最为显著，miR-21上调最为显著，该研究指出miR-129、miR-133b等属于具有预测肿瘤进展潜能的重要miRNA。本次研究中利用实时荧光定量检验对膀胱癌标本和癌旁组织进行了miR-30b的表达检测，结果发现miR-30b在膀胱癌组织中的表达显著低于正常组织，这提示miR-30b可能与膀胱癌的发生有所相关。

Nagaraja等[14]研究认为不同分级的膀胱癌的发生、发展途径有所不同。有相关研究显示，不同分级的膀胱癌的miRNA表达谱也存在显著差异，例如miR-125b在肌层浸润性膀胱癌中的表达最高，而miR-10则在浅表性膀胱癌中的表达最高。从本次研究情况来看，miR-30b在不同临床分期患者中的表达并无差异，考虑原因主要是本次选择标本均为浸润性膀胱癌。但从病理分级来看，miR-30b的表达与肿瘤组织的分化程度有所相关，高分化的癌症组织中miR-30b的表达相对较高，中低分化组织中的表达则相对较低，提示miR-30b可能具有抑癌基因的特点。

研究表明[15，16]，miRNA能够广泛的参与到基因表达的各种生物学调控中，包括细胞的增殖、侵袭、转移及凋亡等。有研究表明[17]，miRNA是肿瘤细胞发生发展的重要因素，与肿瘤的转归也有密切相关，miRNA能够参与到肿瘤细胞的周期调控、转录、血管生成、浸润及凋亡等环节中，正常细胞与癌细胞中的多种miRNA表达均存在显著差异，这说明miRNA可能在肿瘤中扮演中癌基因或抑癌基因的角色。Goebell等[18]的报道指出，包括miR-221、miR-223、miR-23b、miR-26b在内的多种miRNA均能够在膀胱上皮癌中异常表达。Guertin等[19]的研究发现了miR-200家族，并指出miR-205在膀胱癌组织中的表达显著降低。

细胞增殖是细胞生命活动的最基本特征。本次研究结果显示，miR-30b在膀胱癌T24细胞中的增值速度与阴性对照组相比明显降低，提示miR-30b能够抑制T24细胞的增殖，发挥了抑癌基因的效果。

侵袭能力是导致癌性肿瘤患者死亡的重要因素，属于一个复杂的动态性过程。近年来的研究显示miRNA的表达能够影响肿瘤细胞的侵袭性，Castedo等[20]的研究显示miRNA200家族在未分化甲状腺癌中的表达显著低于高分化甲状腺癌，推测此类miRNA的表达降低能够促进未分化甲状腺癌的潜在侵袭性。从本次侵袭转移研究来看，miR-30b转染组的T24细胞的侵袭能力相较于阴性对照组而言明显减弱，这提示miR-30b具有抑制膀胱癌细胞侵袭能力的作用。

肿瘤细胞的凋亡与增殖功能相反，同样决定着肿瘤的消长能力。越来越多的研究显示miRNA属于调控癌症细胞增殖和凋亡的重要因素。Hansel等[21]的研究显示miR-21在乳腺癌组织中的表达显著增高，利用抗肿瘤ASO片段抑制乳腺癌细胞miR-21的表达后，乳腺癌细胞的生长明显受到抑制，细胞的凋亡率增加，这个研究显示miR-21的表达降低能够促进乳腺癌组织的凋亡。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡过程中有着重要的作用，caspase通常以酶原形式存在，在正常组织和肿瘤组织中均有表达，一旦caspase被激活并执行致命性切割指令，即会引起细胞的凋亡[22]。本次研究检测T24癌细胞的凋亡即是基于caspase的特性，利用测定吸光度来检测caspase-3的活性。本次研究显示，miR-30b转染组的凋亡率显著高于阴性对照组，提示miR-30b的表达越低，细胞的凋亡率也就越低。

综上所述，膀胱癌组织中的miR-30b表达水平显著低于癌旁组织，提示miR-30b的水平与膀胱癌的发生发展有所相关，miR-30b的表达与临床分期无关，但与病理分期显著相关，miR-30b导入膀胱癌细胞后，能够显著抑制癌细胞的侵袭能力，加速癌细胞的凋亡。