单细胞转录组测序分析人类胚胎发育阻滞的潜在机制

许常龙， 李春苑， 杨 华， 吕 波， 薛志刚，3， 丘 映

(1. 南宁市第二人民医院生殖医疗中心，南宁 530031； 2. 同济大学医学院再生医学系，上海 200092；3. 同济大学附属同济医院干细胞研究临床转化中心，上海 200065)

哺乳动物早期胚胎发育阻滞是进行胚胎体外培养中的普遍现象。人们在使用合成培养液培养不同动物的胚胎时发现，小鼠和大鼠在2细胞阶段，兔和猪在4细胞阶段，牛、绵羊等在8至16细胞阶段，人类在卵裂期阶段都会出现发育停止的现象[1]。哺乳动物的体外发育阻滞与三方面的因素有关，即： 胚胎种类、配子(卵子与精子)质量、体外培养环境(培养液成分与培养条件)[2]。研究者从不同角度对小鼠等动物的早期胚胎发育阻滞现象进行了研究，取得了很多进展[3]，但目前对人类胚胎体外发育阻滞的研究尚处于初步探索阶段。人类早期胚胎发育是胚胎发育的关键阶段，在这个过程中，胚胎中基因的转录和表达经历了一系列巨大变化，包括受精后再程序化、基因组激活、细胞分化表观遗传状态的转换、X染色体失活等[4-5]。单细胞RNA-seq技术的出现为高精确地检测和分析胚胎早期转录谱提供了前所未有的契机，该技术可以利用单个细胞作为样本材料，全面、深入地分析转录组[6-7]。本课题利用单细胞RNA-seq技术，对南宁市第二人民医院生殖医疗中心行体外受精(in-vitro fertilization, IVF)和胞质内单精子注射(intracytop-lasmic sperm injection, ICSI)术中的发育阻滞废弃胚胎检测其转录组情况，结合团队前期数据[8]及Yan等[9]的植入前胚胎单细胞数据作为人类早期胚胎转录组的正常对照数据，研究和分析了人类早期胚胎发育阻滞的分子机制。

1 材料与方法

1.1 植入前胚胎分组

正常发育植入前胚胎单细胞数据来源于Yan等[9]及Xue等[8]的数据；阻滞胚胎数据来源于生殖中心废弃胚胎(分为IVF组和ICSI组)，阻滞胚胎实验通过南宁市第二人民医院医学伦理委员会批准(伦理号： KYXM201501)，并与正常胚胎发育比较，依据停滞发育时期的时间及细胞数量定义为原核期(Zygote)阻滞、2 cell阻滞、4 cell阻滞、8 cell阻滞、16 cell阻滞胚胎(表1)，经过单细胞转录组建库、测序获得。

1.2 方法

1.2.1 阻滞胚胎培养试剂、鉴定、收集和处理 胚胎体外培养试剂： Quinn,sAdvantageTM第三代HTF培养液(受精)；Quinn, sAdvantageTM卵裂培养液(卵裂期)；Quinn, sAdvantageTM囊胚培养液(囊胚培养)。

表1 阻滞胚胎分组情况统计

阻滞胚胎鉴定： 采集促排卵的卵子，在体外与精子进行IVF或ICSI完成受精，第2天观察受精原核情况，第3、4天观察胚胎卵裂情况，第5天观察卵裂球融合情况。如果受精后胚胎在第3天仍处于原核期则列为Zygote阻滞；第4天起，第N天胚胎卵裂球数量与N-1天相同，则根据时间和卵裂球数量列为2 cell至16 cell发育阻滞。

胚胎活性鉴定： 胚胎操作人员会根据胚胎的发育，卵裂球是否完整、细胞膜是否破裂等来判断胚胎是否已经死亡。

阻滞胚胎单细胞处理： 利用Tyrode酸将发育阻滞的胚胎透明带消化掉，然后用0.25%胰酶将裸露的胚胎消化成单个细胞；利用单细胞转移装置将卵裂球转移至裂解液中，准备下一步的单细胞建库。

1.2.2 单细胞建库方法 运用Smart-seq2单细胞转录组建库方法[10]反转录成cDNA，其中0.1ng cDNA用于Nextera标记及文库构建，利用Agilent Bioanalyzer 2100对上机文库进行质量检测，运用IlluminaHiseq 2500测序仪对文库测序。

1.2.3 单细胞转录组测序及数据处理 测序完成后，用Casava1.8.2软件将图像格式的测序数据转化为fastq格式，并根据每个样品接头上的分组信息从下机数据中分离每个样品的测序数据；用Bowtie默认参数将读长与hg38人类基因组参考序列比对，过滤掉在基因组上有多个比对位点和落在核糖体上的序列；用TopHat、Cufflinks等软件计算比对在外显子上reads的数量，并用每千个碱基的转录每百万映射读取的reads(reads per kilobase per million mapped reads, RPKM)值来表示基因表达高低。

1.2.4 加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA) 采用R语言WGCNA软件包[11]，参数设置参照文献[8]： (1) 获取单细胞转录组数据，构建所有检测样品中的所有基因之间的相关系数矩阵；(2) 提高基因共表达的量度构建邻接矩阵，计算拓扑重叠，0.5+0.5X关系矩阵，软阈值选取默认值β=12；(3) 基因高度相似的共表达关系组合，拓扑重叠上进行平均连接分层聚类；(4) 使用动态混合树修剪算法削减层次聚类树，定义模块；(5) 把每个模块的表达谱作为第一主成分进行归纳，合并特征基因高度相关的模块。

2 结 果

2.1 阻滞胚胎单细胞聚类分析

通过NCBI数据库胚胎、胚胎干细胞的单细胞数据收集，一共获得153个正常单细胞样本；通过生殖中心患者捐献的废弃发育阻滞胚胎，数据质控，一共获得34个阻滞胚胎单细胞样本。通过聚类分析，剔除异常单细胞转录组数据(图1蓝色方框Outlier)，结果显示，阻滞胚胎各阶段(图1蓝色椭圆框)合子期至4细胞期(zygote to 4-cell stage)、8细胞至16细胞期(8 to 16-cell stage)、囊胚期(blastocyst)都与正常发育的胚胎聚在一起。

图1 阻滞胚胎与正常胚胎、胚胎干细胞ES的聚类图Fig.1 Cluster dendrogram of arrested embryos, normal embryos and embryo stem cells

2.2 阻滞胚胎WGCNA分析

为了探究胚胎发生阻滞的可能原因，本研究通过WGCNA方法分析，使用默认参数进行分析，结果显示包括阻滞胚胎在内各阶段基因表达程序具有一定的保守性(图2)。图2上方的树状聚类把基因分成了多个模块，通过模块特征基因相关性检测分析(图3)，结果显示pink等模块在阻滞胚胎中具有非常高的相关性，但在正常胚胎中的相关性较低，即正常情况下负相关的表达趋势的基因在阻滞的胚胎样品中表现出正相关的表达趋势。

图2 WGCNA分析阻滞胚胎与正常胚胎各阶段表达模块Fig.2 Hierarchical cluster tree showing co-expression modules identified using WGCNA

图3 阻滞、正常胚胎各阶段模块相关性分析Fig.3 Module-trait relationships between arrested and normal embryos

2.3 阻滞胚胎高相关性信号网络及关键基因分析

通过筛选在阻滞胚胎中高相关性的pink模块，对其深入分析发现其中包含30个基因，通过对这些模块基因间作用网络分析(图4)，结果显示，属于蛋白激酶超家族的MKNK2基因处于较为中心的位置，其所编码的蛋白处于MAP激酶下游，对于细胞内信号传递起着非常关键的作用。另一方面，对这些基因进行GO分析发现，这些基因富集在多个生物学功能，例如细胞代谢、细胞生长、蛋白定位等过程，见表2。

图4 基因间作用网络分析(阻滞胚胎vs正常胚胎)Fig.4 Module visualization of network connections and associated function(arrested embryos vs normal embryos)

2.4 IVF与ICSI技术对阻滞胚胎发育的影响

为进一步比较IVF方法和ICSI方法对胚胎发育阻滞的影响差异，本研究筛选了在两组阻滞胚胎样本间相关性存在差异的模块，即在IVF组中相关性高于ICSI组的green模块(图3)，这个模块包含29个基因，通过基因间作用网络分析(图5)，处于网络中心的TUBB、CLDN7、YARS基因分别属于微管蛋白构成、与紧密连接相关的膜蛋白、tRNA氨基酰化反应酶等，结合GO分析发现，green模块基因主要参与了线粒体结构、内膜的合成、细胞骨架等生物学过程，提示IVF与ICSI技术可能会对胚胎发育潜能产生不同的影响，见表3。

表2 pink模块基因GO分析

表3 green模块基因GO分析

(续表2)

图5 基因间作用网络分析(IVF vs ICSI)Fig.5 Module visualization of network connections and associated function(IVF vs ICSI)

3 讨 论

哺乳动物早期胚胎发育是一个复杂的过程，包括一系列重要的发育阶段： 卵母细胞的成熟、受精和着床前胚胎发育。在基因表达、蛋白水平及表观遗传等方面也发生了一系列的变化： 母源RNA和蛋白质的降解以及胚胎自身的基因组激活、父源基因组的主动去甲基化、母源基因组的被动去甲基化、组蛋白的修饰变化等特征[12]。这些过程中任意关键信号通路或基因的扰动都有可能导致胚胎发育异常或者阻滞。在人类IVF过程中，受到环境、培养基、操作等一系列外界因素的干扰，胚胎发育阻滞的情况也会时常被观察到。

本研究通过收集IVF和ICSI过程中的阻滞胚胎单细胞，构建单细胞转录组文库，测序结果经过生物信息学分析，发现阻滞胚胎整体表达水平与各阶段正常胚胎基本一致；然而通过WGCNA分析各阶段关键模块时，发现发育受阻胚胎与正常胚胎之间相关性相差较大。通过对高相关性模块深入分析，发现阻滞胚胎的细胞代谢、细胞生长、蛋白定位等过程与正常胚胎之间存在差异，推测这些通路可能是胚胎发育阻滞的原因之一。本研究发现MKNK2基因在其中发挥了重要的功能，而该基因与雌激素受体ERβ有相互作用[13-14]，参与了胚胎发育、植入等重要过程[15]。PHF13编码组蛋白去甲基化酶，可以参与调节染色体结构、影响基因的转录等，且与H3K4me2/3直接作用，影响细胞分化、分裂、DNA损伤修复、染色体结构等功能[16]。这些差异提示，在阻滞胚胎与正常胚胎之间从染色体、DNA等分子结构到细胞代谢等生物过程都存在差异，对于阻滞胚胎的治疗手段研究应该更全面和深入。

本研究也分析了IVF过程和ICSI过程对胚胎发育阻滞的影响，发现在IVF组氧化磷酸化、线粒体膜结构等发生的变化较为显著；这些结果提示IVF和ICSI技术会对胚胎细胞线粒体产生不同的影响，进而造成胚胎发育的阻滞。如线粒体分裂蛋白1(MTFP1)，调节线粒体分裂以及凋亡，进而对细胞活性产生影响[17]；Ndufc2基因编码的NADH脱氢酶亚基，其缺失或者表达受阻会改变线粒体呼吸链复合物1的装配和活性，并且影响线粒体膜电位和ATP含量，增加活性氧产量，进而影响细胞活性[18]。这些结果提示在辅助生殖过程中，选择ICSI作为精卵受精手段时，还应该考虑这个过程对胚胎线粒体可能产生的影响，进而考虑ICSI中同时注射线粒体作为改善ICSI对阻滞胚胎发育影响的可能手段。

综上所述，IVF过程中发生的胚胎发育阻滞现象受到多方面的因素影响，在阻滞胚胎中无论是细胞代谢、细胞间连接、线粒体结构和功能等都发生了变化。同时ICSI和IVF过程的不同也对阻滞胚胎的转录组产生了明显的影响。这些结果为揭示IVF过程中胚胎发育阻滞的机制提供了线索和帮助，同时也为提高辅助生殖成功率、胚胎优生优育提供新的思路。