31例多发性硬化患者T淋巴细胞亚群及相关细胞因子的检测

李丹

（威海市立医院南院区检验科，威海264200）

多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统脱髓鞘病变为主的自身免疫性疾病，常见于欧美国家，中国发病率较低，为1/10万~2/10万[1]。MS确切的病因及发病机制尚未清楚。通常认为，MS的发生与遗传因素、自身免疫反应及环境因素关系密切。主要病理改变是免疫活性细胞浸润、轴索损伤及髓鞘脱失，主要的临床表现为进行性神经功能障碍，随着病程的进展，双下肢瘫痪为绝大多数患者最终的结果。目前为止尚无根治MS的方法，常用的是激素治疗和免疫抑制，可明显缓解急性期和复发期的病程，但病损程度却不能减轻，长期疗效也不肯定，且毒副作用很大。本文通过对31例MS患者静脉血T淋巴细胞亚群及相关细胞因子含量的检测，探讨Th17细胞、Treg细胞在多发性硬化发病中的作用，为今后临床治疗多发性硬化提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月-2017年8月威海市立医院神经内科门诊及住院MS患者31例，男13例，女18例；平均年龄（37±11）岁，均符合 2005年修订的Mcdonald诊断标准；正常对照组选自同期该院健康体检者20例，平均年龄（38±12）岁。排除标准：（1）并发严重心、脑血管疾病，肝、肾功能不全；（2）急、慢性感染；（3）合并其他自身免疫性疾病；（4）应用免疫调节剂、非甾体类抗炎药物者；（5）肿瘤；（6）合并妊娠。

1.2 仪器与试剂 仪器采用美国BD FACSCalibur流式细胞仪，小鼠抗人荧光标记的抗体、同型对照抗体小鼠IgG，流式微球芯片捕获技术细胞因子试剂盒均购自美国BD公司；小鼠抗人IL-17-FITC购自eBiocience公司；淋巴细胞分离液、佛波酯乙醇、离子霉素、蛋白质转运抑制剂莫能霉素购自Sigma公司。

1.3 标本采集 31例门诊及住院MS患者初诊和泼尼松治疗4周后均清晨空腹采集肘静脉血标本5 mL于肝素钠抗凝管中，3 mL血标本用于分离外周血单个核细胞进行流式细胞学检测，2 mL血标本离心后留取血浆于EP管中保存在-80°C低温冰箱中用于检测细胞因子，随机抽取20名同期健康体检人员采集相应血液标本作为对照检查。

1.4 流式细胞仪检测 T淋巴细胞亚群加入等体积PBS稀释静脉血，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。加入10 mg/L的布雷菲德菌素A、1 mg/L的离子霉素和0.02 mg/L的佛波酯，37℃培养箱孵育4 h。3 000 r/min离心5 min，弃去上清液收集细胞，调整细胞浓度至1×106/mL，取细胞悬液300 μL，按淋巴细胞亚群配对方案分别加入10 μL荧光标记mAbCD4-APC、CD8-PercP，室温避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定20 min，加破膜缓冲液作用10 min。按组合方案加入相应的小鼠抗人mAbIFN-γ-FITC、IL-4-PE、IL-17-FITC、FOXP3-PE，室温避光孵育30 min，PBS充分洗涤，1%多聚甲醛固定，上机检测，每份标本采集的细胞数≥20 000个，采用Cell Quest分析。

1.5 流式微球芯片捕获技术（CBA）检测血浆细胞因子 通过BD FACSComp软件设置FCM的基本参数，按照试剂盒中细胞因子标准品梯度法依次稀释成以下 8 个浓度：1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256，加上阴性对照和最高浓度绘制各细胞因子标准曲线。待测血浆1 500 r/min离心5 min，吸取50μL上清液于待测管中，加入5种捕获微球混合物 50 μL，孵育 1 h，再加入 50 μL PE 检测试剂，室温避光孵育2 h。加入1 mL洗液，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入300μL洗液上机，使用CellQuest检测。将标准品和待测样品捕获数据转入BD FCAP Array软件，绘出标准曲线，分析待测样品的细胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4、IL-10 含量。

2 结果

2.1 3组外周血T淋巴细胞亚群与正常组比较 MS组Th1细胞和Th17细胞均明显升高（P＜0.05）；Treg细胞和TC1细胞显著下降（P＜0.01），Th17/Treg比例明显升高（P＜0.01）；与 MS 组比较，泼尼松组 Tc1、Tc2和Treg细胞百分率均明显升高（P＜0.01），而Th1和 Th17细胞显著下降（P＜0.05)，Th17/Treg比值降低（P＜0.01）（表 1，图 1）。

2.2 血浆细胞因子的变化与正常组比较 MS组IFN-γ 和 IL-17A 含量升高（P＜0.05；P＜0.01），IL-4 和IL-10含量明显降低（P＜0.01）；与 MS组比较，泼尼松组IL-17A含量明显降低（P＜0.01），IL-4和IL-10均显著升高（P＜0.01）（表 2）。

表1 3组外周血T淋巴细胞亚群的变化（±s）Tab 1 Changes of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in three groups（±s）

表1 3组外周血T淋巴细胞亚群的变化（±s）Tab 1 Changes of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in three groups（±s）

▲：P＜0.01,vs正常组；#：P＜0.05，*：P＜0.01，vsMS 组

组别T淋巴细胞亚群/% Th1/Th2 Th17/Treg Th1 Th2 Th17 Treg TC1 TC2正常组 0.54±0.27 1.96±0.44 3.12±1.67 35.04±4.21 3.39±1.42 4.57±1.87 0.36±0.12 0.10±0.02 MS 组 1.57±0.20▲ 1.84±0.36 15.24±2.54▲ 10.12±4.13▲ 0.62±0.18▲ 3.35±1.31 0.91±0.33 1.51±0.62▲泼尼松组 0.70±0.30# 1.13±0.39 6.12±2.04# 29.52±12.01* 2.97±0.69* 13.70±7.22* 0.61±0.97 0.19±0.07*

图1 3组外周血淋巴细胞亚群FCM图Fig 1 Phenotype of lymphocyte subsets analyzed by FCM in three groups

表 2 3 组血浆细胞因子的含量（±s，pg/mL）Tab 2 Concentrations of plasma cytokines in three groups（±s，pg/mL）

表 2 3 组血浆细胞因子的含量（±s，pg/mL）Tab 2 Concentrations of plasma cytokines in three groups（±s，pg/mL）

▲：P＜0.05，&：P＜0.01，vs正常组；*：P＜0.01，vsMS 组

组别 Th1型细胞因子 Th2型细胞因子 Th17型细胞因子IFN-γ TNF-α IL-10 IL-4 IL-17A正常组 8.53±1.42 378.21±283.72 36.65±15.41 13.07±7.24 22.53±2.26 MS 组 17.54±4.20▲ 241.03±132.40 12.10±10.21& 3.83±1.10& 269.97±75.93&泼尼松组 12.40±1.30 211.04±110.45 66.45±14.31* 9.20±1.93* 50.63±8.62*

3 讨论

过去普遍认为，Th1细胞活性异常升高是MS的重要免疫发病机制，MS是由Th1细胞介导的。近年来，Th17细胞成为免疫学研究的热点，研究发现其在自身免疫性疾病发病过程中发挥重要作用[1-2]。Th17细胞是一类独立的CD4+T细胞，因活化后可以产生IL-17而得名，IL-17是早期产生的具有广泛生物学活性的炎性细胞因子，Th17细胞同时也分泌IL-21、IL-22、IL-26、IL-29和 TNF-α 等，这些细胞因子可以诱导促炎性细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，引起组织细胞炎性浸润和组织破坏[3]，进而引起自身免疫性疾病的发生。已有研究证明在MS患者病灶中IL-17转录上调，且脑脊液中IL-17表达明显高于正常对照组[4]。国内研究已证明在多发性硬化动物模型 EAE（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE） 大鼠外周血中CD4+IL-17+（Th17）细胞亚群百分率明显升高，且在EAE模型组脑和脊髓组织呈现大量炎性细胞浸润，有血管套形成[5-6]。

本研究中MS患者静脉血中Th1和Th17细胞亚群百分率明显升高，而Treg细胞百分比显著降低，且Th17/Treg比例也明显升高。有研究报道，FoxP3+Treg可以调节机体对外源性抗原免疫反应的程度，其功能失调与多种疾病密切相关如自身免疫性疾病、过敏性疾病、感染性疾病等[7-8]。正常情况下，Th17和FoxP3+Treg细胞之间相互拮抗、制约，维持两者的生理平衡是机体抗感染免疫和自身免疫耐受的重要机制。通过本实验推测，MS的发生与Th17/Treg比例失衡关系密切。因此探讨靶向抑制Th17细胞和调节FoxP3+Treg细胞是目前自身免疫性疾病重要的免疫治疗方向。目前，临床上治疗多发性硬化大多应用激素和非特异性的免疫抑制剂，本实验中泼尼松治疗组Tc1、Tc2和Treg细胞百分率均明显升高，而Th1和Th17细胞显著下降，Th17/Treg比值降低；IL-17A含量明显降低，IL-4和IL-10均显著升高，在一定程度上可以缓解MS的症状，但是毒副作用较大,不适合长期使用，因此，寻找靶向免疫调节Th17/Treg失衡可能是今后临床治疗MS的新希望。已有研究报道，干细胞不仅具有自我复制及定向分化的功能，更能发挥巨大的免疫调节功能，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE） 模型具有明显的效果，主要是MSCs抑制T淋巴细胞增殖，下调Th1和Th17，上调Th2和Treg细胞，纠正Th1/Th2、Th17/Treg失衡，机制可能主要与其抑制炎性细胞因子及促进抗炎细胞因子分泌密切相关[9-13]。国内也已有研究证实人羊膜间充质干细胞、人羊膜上皮细胞，可以下调Th17细胞的表达，上调FoxP3+Treg细胞的表达，纠正Th17/Treg失衡[5-6]。

在免疫系统中，各类细胞因子相互协同或制约发挥着重要的免疫调节作用，本文通过检测Th1和Th2型细胞因子发现，MS组Th1型细胞因子IFN-γ含量均明显高于正常组，Th2型细胞因子IL-10和IL-4则明显降低，推测通过调节Th1/Th2型细胞因子的平衡也是减轻MS免疫损伤的重要机制之一。本实验采用CBA方法检测血浆细胞因子含量，与传统的ELISA和Western blot技术相比，该种方法不仅标本用量少，检测速度更快，结果更精准，灵敏度更高，值得临床研究及实验室广泛应用。同时，本研究由于样本量较少也存在一定的局限性，今后的研究中要增加临床样本量，降低结果的误差。本实验推测，MS的发生与Th17/Treg比例失衡和Th1/Th2型细胞因子的失衡关系密切，但在MS的发生发展过程中具体通过什么途径促使Th17表达上调，Treg表达下调，还不完全清楚，是今后研究的重点内容，此外TC1和TC2淋巴细胞亚群在MS中意义尚不清楚，值得进一步探讨。