TIM-3-574G>T基因多态性与中国汉族人群支气管哮喘的相关性分析

梁卓政 郭 程 孟 平 李洪涛 张天托

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症为基础的异质性疾病，发作时其主要症状包括胸闷、咳嗽、喘息气短等，并有可逆性气流受限[1-2]。哮喘作为一种与过敏相关的疾病，CD4+T细胞在其发病过程中起着重要作用。在免疫应答过程中CD4+T细胞在不同类型抗原刺激下可继续分化，根据所分泌的细胞因子不同可分为Th1和Th2两个亚群。Th1/Th2细胞发挥正常功能及数量上保持平衡状态是维持机体正常免疫的基础；Th1/Th2细胞功能异常或失衡，是引起多种免疫相关疾病的重要因素。一般认为哮喘发病机制中存在向Th2细胞的免疫偏离。

直到现在，尽管哮喘的病因仍然不明，但是可以确定基因与其发病密切相关[3]。近几年来，全基因组技术的应用证实了多种基因与哮喘发生的密切关系。Toll样受体2和4(TLR2、TLR4)、血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)、整合素和金属蛋白酶33(ADAM33)、CD14、IL-4R和IL-6R等的基因多态性与哮喘易感性之间的关系已得到大量的研究支持[4-9]。有文献显示TIM-3-574 G>T基因多态性与中国人群支气管哮喘的发病风险有关，然而由于单个研究样本量有限，各研究结果存在一定差异。因此，本文利用已发表的中国汉族人群支气管哮喘与TIM-3-574G>T基因多态性的相关研究进行Meta分析，旨在通过对多个独立研究进行定量合并，增大样本量，增加结果的说服力，弥补单个研究样本量不足的缺点。

资料与方法

一、数据库和检索词

选择Pubmed、Embase、Web of Science(WOS)、CNKI、万方数据库以及SinoMed进行检索，末次检索时间为2017年12月20日。使用如下关键词检索：哮喘(asthma)、多态(polymorphism* or variant*)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-3(T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein-3 or TIM-3)，结合高级检索(将字段限定在中文的“主题”与英文的“Title/Abstract”)和主题词检索策略对相关文献进行筛选，同时采用文献追踪的方法继续跟踪之后可能出现的最新研究文献。筛选流程如图1所示。

二、文献资料的纳入标准和排除标准

1. 纳入标准

(1)所有文献均需提供诊断其患者为支气管哮喘诊断标准：①反复发作的胸闷、咳嗽、喘息气短；②发作时在双肺可闻及散在或弥漫性、以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长；③上述症状经平喘药物治疗后可缓解或自行缓解；④排除其他疾病引起的胸闷、咳嗽、喘息气短；⑤临床表现不典型者应至少具备以下一项试验阳性：a.支气管激发试验或运动试验阳性；b.支气管舒张试验阳性(1 s用力呼气容积增加15%以上，且增加绝对值>200 ml)；c.最大呼气流量日内变异率或昼夜波动率≥20%；符合以上1～4项或4～5项者，可以诊断为哮喘。

图1 Meta分析纳入文献筛选流程图

(2)文献设计类型病例对照研究。

(3)文献中有提供TIM-3-574 G>T(rs10515746)多态性的检测信息，并提供统计软件分析所需的数据。

(4)对照组人群的基因型频率分布需满足Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

(5)病例组与对照组之间具有可比性，即年龄、种族等比较差异无统计学意义。

2. 排除标准：①以家族系为背景的研究;②文献提供的信息不全或无法进行统计分析的文献；③同一篇文献结果重复发表，取其样本量最大，可提供信息最全的一篇作为纳入文献;④学位论文、会议文献;⑤研究对象为非中国汉族人种；⑥参考The Newcastle-Ottawa quality assessment scale(NOS)的病例对照研究文献质量评价标准[10]进行文献质量评估，剔除评分比较低的文献。

三、研究方法

由两名研究人员使用上述统一的纳入标准和排除标准进行文献筛选，独立提取数据，并制成数据提取表，而后相互交换核对，最后达到意见统一，数据一致。提取的内容包括：第一作者、发表年份、研究类型、国家、人群的种族、基因多态性检测手段以及TIM-3-574 G>T(rs10515746)基因型频率分布数据等。

四、统计学方法

采用RevMan 5.3软件对提取的数据进行统计分析。由于纳入的文献中均没有TIM-3 rs10515746 TT基因型数据，故使用显性模型GT/GG以及位点比较模型G/T对提取的数据进行统计分析，以OR值和95%CI作为研究效应指标，并对研究结果的进行异质性检验。若检验统计量I2<50%，说明各纳入文献之间异质性比较小，可采用固定效应模型进行合并；若检验统计量I2>50%，说明各纳入文献之间异质性相对比较大，则应采用更为保守的随机效应模型进行合并。如果存在异质性，则需寻找异质性来源，对纳入的文献进行亚组分析、敏感性分析等。利用Stata 12软件做Begg法和Egger直线回归对文献发表偏倚进行评估。

结 果

一、纳入文献的基本信息

从外文数据库和中文数据库中共找到相关文献57篇，根据预先制定好的纳入标准，并排除研究数据重复的和不满足Hardy-Weinberg平衡的文献，最终纳入5篇文献，其基本信息见表1。累计哮喘组患者1 241例，均符合现公认的支气管哮喘诊断标准，对照组患者1 005例。各研究对象的提取的信息及基因频率，见表2。

二、异质性检验

各研究的Hardy-Weinberg平衡P值均>0.05，说明纳入的5篇文献所收集的人群代表性比较好。由于缺乏TT基因型的数据，故使用显性模型GT/GG以及位点比较模型G/T的OR值和95%CI作为合并各个研究资料的效应指标，并对各模型中的文献作异质性检验。经RevMan 5.3分析，显性模型GT/GG和位点比较模型G/T中纳入的各研究中不存在异质性，故两模型均采用固定效应模型来分析。

三、TIM-3基因-574 G>T多态性与哮喘易感性的分析结果

哮喘病例组和对照组在显性模型和位点比较模型中差异有统计学意义，结果见图2、图3。显性模型GT/GG合并后的OR值为4.06(95%CI：2.34,7.05)，结果表明GT基因型的分布与哮喘的易感性有统计学意义，携带有GT突变基因型的个体患哮喘的风险是野生型纯合子GG个体的4.06倍。位点比较模型G/T的合并OR值为4.31(95%CI：2.50,7.43)，结果说明TIM-3 -574位点上T基因的突变会增加哮喘的易感性。与野生型G等位基因相比，TIM-3 -574位点上携带有T基因的个人患哮喘的风险增加3.31倍。

表1 Meta分析纳入的5篇文献基本信息特征

注：Pa：为对照组的Hardy-Weinberg遗传平衡定律统计量

表2 5篇纳入文献中基因型和等位基因频率的分布特点[n(%)]

注：a：均数±标准差；b：年龄范围

图2 TIM-3基因-574 G>T多态性与哮喘易感性(显性模型GT/GG)

图3 TIM-3基因-574 G>T多态性等位基因与哮喘易感性(位点比较模型G/T)

四、发表偏倚

利用Stata 12对该研究纳入文献的发表偏倚情况进行定量分析。Begg法结果值为Z=1.22，P=0.221，Egger法结果值为t=3.42，P=0.042，按照α=0.1检验水准，两者结果不一致，说明本文纳入文献可能存在发表偏倚。

五、敏感性分析

本文中纳入的文献之间不存在异质性，利用随机效应模型对纳入文献的显性模型再次合并计算，结果并未发生改变。显性模型中剔除一篇权重最大的李际盛等[14]的研究后，利用固定效应模型进行计算，合并的OR值为5.41(95%CI：2.62,11.16)，I2=0。因此，上述处理结果均显示本文结果较为稳定。

六、亚组分析

以年龄作为划分，将资料病例人群分为儿童组和成人组，利用亚组分析对显性模型进行分析，由于巫学兰[12]这篇文献纳入的病例组和对照组人群中有成人也有儿童，故无法纳入亚组分组，合并结果见图4。儿童组的合并OR值为4.07(95%CI：1.62，10.20)，I2=0；成人组的合并OR值为3.49(95%CI，1.92,6.37)，I2=13%。说明TIM-3基因-574 G>T多态性与儿童和成人哮喘的易感性有关系。

图4 TIM-3基因-574 G>T多态性与哮喘易感性的年龄亚组分析(显性模型GT/GG)

讨论

T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白(TIM)家族是T细胞Ⅰ型跨膜蛋白，其N末端有Ⅴ型Ig结构域，该结构域上有长度可变的黏蛋白结构域、包含一个与N原子连接的糖基化位点以及数个与O原子连接的糖基化位点[16]。小鼠的TIM基因家族定位于染色体11B1.1，包含TIM1-8，而人类的TIM基因家族定位于染色体5q33.2，包含3个成员，即TIM-1、TIM-3和TIM-4，其在啮齿类动物和人类之间无论从表达情况还是功能结构都具有同源性，其余5种TIM基因只在啮齿类动物中表达[17]。TIM-1、TIM-3、TIM-4在分子结构和功能上都具有不同的特点。TIM-1主要在Th2细胞中表达，Umetsu等[18]发现利用抗原和TIM-1单克隆抗体(TIM-1 Ig)对体外Th2细胞进行共刺激培养，可见T细胞大量增殖，IL-4分泌明显升高，但不分泌IFN-γ；而与对照组相比，小鼠体内给予TIM-1 Ig处理后，体外分离得到的T细胞大量增殖，分泌大量的IL-4、IL-10和IFN-γ。Xie等[19]的相关性分析表明TIM-1 416G>C的基因多态性与中国汉族人的哮喘易感性有关，但5383_5397位点上插入/缺失的多态性与哮喘的发病风险无关。TIM-3主要表达于分化成熟的Th1细胞而不表达于Th2 细胞，负性调节Th1型免疫反应。Th17也有少量表达，而Th2细胞不表达[20]。Anderson等[21]研究发现TIM-3在单核细胞以及树突状细胞中也有表达，而且在固有免疫与获得性免疫中TIM-3发挥着截然不同的作用。在固有免疫中，TIM-3协同Toll样受体增加TNF-α的分泌，从而促进炎症发展；在获得性免疫中，TIM-3通过IFN-γ上调其配体半乳凝素-9，后者结合在Th1细胞表面的TIM-3后，可使钙离子内流增加，从而介导Th1细胞凋亡[22]。

本文显示TIM-3-574 G>T多态性与哮喘易感性有关，携带有GT突变基因型的个体患哮喘的风险是野生型纯合子GG个体的4.06倍。因此，推测TIM-3-574 位点上T基因的突变可能会激活TIM-3或者增强其活性，IFN-γ分泌增多，促使半乳凝素-9上调，后者与Th1细胞表面的TIM-3结合后，可使钙离子内流增加，Th1细胞发生钙超载，从而介导Th1细胞凋亡，导致Th1/Th2 平衡向Th2偏移，最终导致哮喘的发生。

另外，以年龄作分组进行亚组分析，发现TIM-3-574位点上T基因的突变对儿童哮喘发病的影响可能比成人的影响更大(儿童组：OR=4.07，95%CI：1.62，10.20；成人组：OR=3.09，95%CI：1.40,6.85)，我们推测导致该结果的原因可能有两个：①儿童免疫系统发育尚未成熟，对外来刺激反应更为敏感，TIM-3-574位点可能更容易发生突变，导致哮喘发生风险增加；②可能由于两组样本量不足导致结果偏差。

目前国内外有多个TIM-3-574 G>T多态性与人类支气管哮喘的易感性相关的研究，但大部分都是中国汉族人种，对伊朗波斯人和韩国人与TIM-3基因多态性相关性的研究各有一篇[23-24]，考虑到其他人种的研究数量不足，为了排除人种的影响，故本文仅纳入中国汉族地区人群的研究。本文纳入的研究数目较少，每个研究纳入的样本量不够大，人种相对单一，从而无法进一步分层分析，故存在一定局限性，尚需要更大的样本量予以支持以及不同人种的哮喘与TIM-3基因多态性的研究。此外，本文纳入的文献NOS评分不高，未能得到每一个研究中更多的详细信息(如巫学兰等[12]的研究中未把研究对象分为儿童组与成人组)。因纳入的文献中未能提供有关环境的信息，也无法对基因-基因及基因-环境的交互作用进行分析，因而需要更全面更高质量评分的文献来进一步支持研究结果和阐明哮喘的发病机制。

综上所述，TIM-3-574 G>T单核苷酸多态性变异与中国汉族人群支气管哮喘患病风险有高度相关性，且T基因的突变可能使儿童组的发病风险比成人组的更高。