60Co-γ射线对海州常山的辐照效应

杨秀莲，张莹婷，何 岭，李海燕，陈贡伟，王良桂

（南京林业大学 风景园林学院，江苏 南京 210037）

海州常山Clerodendrum trichotomum，别名臭梧桐，为马鞭草科Verbenaceae大青属Clerodendrum多年生落叶小乔木，广泛分布在我国华北、华东、中南和西南等地，朝鲜、日本、菲律宾也有分布。海州常山花序可同时出现红色花萼、粉白色花冠和兰紫色果实，色彩丰富，加上其花香四溢、生长迅速和适应性广，是一种优良的观赏木本花卉[1-3]。海州常山推广开发亟需进一步对其观赏品质进行改善，并研究培育海州常山新品种。在植物传统植物育种中，杂交育种的重要手段之一为人工授粉[4-5]，辐射育种相对于杂交育种可以更方便快捷获得植物新品种。 刘军丽等[6]认为60Co-γ射线可使嫁接海棠幼苗表现出明显的矮化，抗虫性提高，叶面积降低，叶厚度增加，叶色加深。尹航等[7]在对库尔勒香梨辐射效应的研究中认为被辐射枝条嫁接第2年枝条间距增大，叶片面积减小，辐射有利于果实含糖量的增加。

近年来对海州常山的研究主要集中在抗逆性研究、药用价值开发、无性繁殖等方面，前人几乎没有开展育种工作，至于以海州常山插穗为材料进行辐照育种更为鲜见。为此本研究以海州常山休眠枝条和当年生枝条为材料，主要探讨不同剂量的60Co-γ射线对海州常山扦插材料的光合特性和生长特性的影响，为掌握辐照对海州常山光合效率与产量的影响、丰富观赏性状提供理论依据；也为进一步培育海州常山品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

2017年3月6日，在南京喜悦科技股份有限公司使用γ辐照装置（BFT14型，北京核二院比尼新技术有限公司），对海州常山休眠枝条进行辐照处理，又于2017年5月4日对海州常山嫩枝进行辐照，且均在辐照翌日扦插在南京林业大学园林实验教学中心温室内。

1.2 材 料

供试材料为海州常山1年生待萌发休眠枝条和当年生半木质化嫩枝，取自南京林业大学白马教学科研基地。枝条剪成平均长度为9 cm的插穗，粗度0.5 cm，具备4个以上饱满的芽体，母本生长健壮，无病虫害。

1.3 方 法

试验采用单因素完全随机设计。设置0（CK）、15、25、35 Gy、4个60Co-γ射线剂量，用1.1 Gy·min-1的剂量率照射供试材料，每剂量照射3组供试插穗，每组60根插穗。辐照完成后立即将插穗用湿润的脱脂棉包裹，扦插于基质深15 cm的插床上，基质以泥炭、珍珠岩、蛭石、河沙按1∶1∶1∶2的体积比配置，定期喷水保湿，插床上方3 m架荫棚，遮阳网透光率40%～50%。在其生长基本停止后测量相关指标。

1.3.1 成活率及半致死剂量的测定

2017年8年5日，用计数法测定海州常山休眠枝和嫩枝插穗成活率，扦插成活率=生根株数/总扦插株数×100%。半致死剂量参照周小梅等[8]和王赵玉等[9]的方法，通过相关系数公式来计算。

1.3.2 形态指标的测定

从2017年8月5日起，2种辐照材料各辐照剂量选择10株代表性单株，带回实验室洗净、擦干。用软尺测量每株新梢的长度，游标卡尺测量新梢基部粗度，同时记录新梢节间数，计算新梢节间长度。

节间长度=新梢长度/节间数。

每株挑选3片正常的功能叶，游标卡尺测量叶片长度、叶片宽度，网格法计算叶片面积。

叶形指数=叶片长度/叶片宽度。

分离单株根系，使用根系扫描仪（ EPSON EXPERSSION V700）扫描出根系图像，后用 Win RHIZO 图像分析软件分析扦插苗总根长、总根表面积和总根体积。

1.3.3 新梢枝条、叶片变异率的统计

从2017年8月5日起，2种辐照材料各辐照剂量选择统计枝条、叶片变异情况，计数法计算海州常山枝条、叶片各变异类型变异率。

枝条变异率=变异枝条数/统计枝条数×100%。

叶片变异率=叶片变异数/统计叶片数×100%。

1.4 数据处理

用SPSS17.0对试验数据进行方差分析，在对照与各辐照剂量处理区之间进行多重对比，用Excel 2003制图。

2 结果与分析

2.1 60Co-γ辐照对不同海州常山插穗成活率的影响

不同辐照剂量对海州常山休眠枝和嫩枝扦插成活率，见表1。由表1可知，在5个60Co-γ辐照剂量处理下，随着剂量的增大，海州常山扦插成活率呈降低的趋势。35 Gy处理后海州常山休眠枝扦插和嫩枝扦插相对成活率均达最低，且低于50%，分别为43.39%、47.01%。25 Gy处理后2种插穗相对成活率分别是52.84%、52.94%，15 Gy处理后为64.16%、76.44%，而0 Gy（CK）处理后的2种海州常山插穗成活率分别为88.33%、18.89%。

表1 60Co-γ辐照对不同海州常山插穗成活率及相对成活率的影响Table 1 Effects of 60Co-γ ray irradiation on survival and relative survival rate of different cuttings of C.trichotomum

2.2 不同海州常山插穗半致死剂量的计算

根据海州常山休眠枝插穗在不同剂量下的相对成活率，拟合直线回归方程（图1），得y=-1.615 3x+95.385，其中y为相对成活率，x为辐照剂量。根据直线回归方程，当y=50时，x=28.10，即海州常山休眠枝插穗的半致死剂量LD50=28.10 Gy，约为28 Gy。如图2，通过对海州常山嫩枝辐照，再根据相对成活率和辐照剂量进行线性回归可知其回归方程为：y= -1.595 3x+ 99.010，y为相对成活率，x为辐照剂量，当y=50时，x=30.72，即海州常山嫩枝插穗的半致死剂量LD50约为31 Gy。

图1 60Co-γ辐照对海州常山休眠枝插穗相对成活率的影响Fig.1 Effects of 60Co-γ ray irradiation on relative survival rate of dormant branch cuttings of C.trichotomum

图2 60Co-γ辐照对海州常山嫩枝插穗相对成活率的影响Fig.2 Effects of 60Co-γ ray irradiation on relative survival rate of dormant branch cuttings of C.trichotomum

2.3 60Co-γ辐照对海州常山新梢的辐照效应

由表2可知，海州常山插穗新梢长度、新梢节间长、新梢基部粗随着辐照剂量的增加，均呈现递减的趋势。在辐照剂量达到35 Gy后，休眠枝插穗新梢长度显著低于对照处理（P＜0.05），较对照组降低35.61%。15～25 Gy处理后新梢长度与对照相比差异不显著（P＞0.05）。海州常山新梢节间长度随辐照剂量增加亦呈递减趋势，35 Gy处理条件下休眠枝节间长度下降明显（P＜0.05），较对照水平下降34.73%。不同辐照剂量对休眠枝插穗新梢基部粗、嫩枝插穗新梢生长影响不显著（P＞0.05）。

表2 60Co-γ辐照对海州常山新梢生长的影响†Table 2 Effects of 60Co-γ ray irradiation on new shoots growth of C.trichotomum

2.4 60Co-γ辐照对海州常山叶形变化的影响

根据表3可以看出，海州常山叶片长度、叶片宽度、叶片面积在15～35 Gy剂量处理下，休眠枝插穗表现出先上升后降低的变化趋势，而嫩枝插穗呈现先降低后上升的趋势。60Co-γ射线处理下，休眠枝插穗与嫩枝插穗叶片长度、叶片宽度、叶片面积生长有所抑制，分别在25和15 Gy出现谷值，其中就叶片面积分别较对照降低了30.71%和29.56%。在15 Gy处理下，休眠枝插穗叶片长度、叶片宽度、叶片面积比对照组升高了0.86%、2.80%、3.29%。对于叶形指数，辐照对其无显著影响（P＞0.05）。

表3 60Co-γ辐照对海州常山叶形变化的影响Table 3 Effects of 60Co-γ ray irradiation on leaf shape of C.trichotomum

2.5 60Co-γ辐照对海州常山根系形态的影响

由表4可以看出，随着辐照剂量的增大，休眠枝插穗幼苗和嫩枝插穗幼苗根系形态指标均呈先降低后上升的趋势。不同剂量辐照处理均可显著降低海州常山休眠枝插穗幼苗总根长、总根表面积、总根体积（P＜0.05），而对嫩枝扦插苗影响不显著（P＞0.05）。60Co-γ射线辐照下，休眠枝插穗幼苗根系形态总体表现出抑制状态，其中在25 Gy处理下，休眠枝插穗幼苗根系形态受到的抑制最严重，总根长、总根表面积、总根体积较对照组分别降低了94.71%、97.03%、92.27%。60Co-γ射线辐照下，嫩枝插穗幼苗根系形态总体表现出升高趋势，其中，35 Gy处理下各形态指标达最大值，分别为对照水平的1.25倍、1.11倍、1.14倍。

表4 60Co-γ辐照对海州常山根系形态的影响Table 4 Effects of 60Co-γ ray irradiation on root morphology of C.trichotomum

2.6 60Co-γ对海州常山枝、叶形态变异的影响

根据表5，海州常山休眠枝经辐照后，扦插苗枝变异率在5.26%～30.77%。随着辐照剂量的增加，休眠枝插穗幼苗枝变异率呈先增后降的趋势，未经辐照插穗幼苗多叉扁化枝数量为0，25 Gy处理的新梢变异率最高，为30.77%，15、35 Gy处理的新梢变异率分别为5.26%、21.88%。经辐照的嫩枝插穗枝变异率在0～25 Gy为0，分叉扁化枝仅出现在35 Gy处理下，枝变异率22.22%。

表5 60Co-γ辐照对海州常山枝形态变异的影响Table 5 Effects of 60Co-γ ray irradiation on branch morphology variation of C.trichotomum

根据表6，随着辐照剂量的增加，休眠枝及嫩枝插穗幼苗叶变异率呈递增变化趋势，且均在35 Gy达到最大值，变异率分别为对照水平的30.37倍和12.92倍。从变异类型来看，休眠枝插穗幼苗叶片变异类型主要为，叶序紊乱（19.17%）＞叶面缺刻（13.70%）＞叶二尖（8.22%）＞叶皱（4.11%）＞叶缺绿（2.74%）＞叶柄合生（1.83%）＞叶斑（0.91%）＞窄叶（0.46%）。15 Gy处理易出现叶面缺刻和叶二尖现象，叶变异率分别为21.56%、15.69%。25、35 Gy出现叶序紊乱类型最多，分别占比36.17%、36.85%。

嫩枝插穗幼苗变异类型主要为叶皱（2.59%）＞叶缺刻（2.04%）＞叶序紊乱（1.36%）叶缺绿(1.23%)＞叶二尖(0.27%)＞叶柄合生(0.14%)＞叶斑（0.14%）。15 Gy易出现叶皱和叶面缺刻类型，变异率分别为4.87%、2.21%。25 Gy叶皱、叶缺绿类型较多，变异率都为2.50%。35 Gy出现叶序紊乱、叶面缺刻变异类型，变异率分别为3.25%、2.44%。

表6 60Co-γ对海州常山叶片形态变异的影响Table 6 Effects of 60Co-γ ray irradiation on leaf morphology variation of C.trichotomum

4 结论与讨论

辐照诱变主要是通过射线辐照诱使植物材料发生遗传物质改变，从而达到表型性状的变异，是选育新品种的有效途径。辐照剂量过低对植物的遗传物质起不到有效的诱变作用，高剂量的辐照会诱变高突变率，但死亡率亦会增加。而且不同的辐照剂量对不同植物和不同来源的植物器官诱变效应不一样，所以选择合适辐照剂量对辐照诱变育种尤为重要[10-11]。一般采用半致死剂量作为辐照育种的合适剂量。本研究中，60Co-γ射线辐照海州常山插穗，辐照剂量与插穗的成活率呈负相关。史玉敏等[12]以桂花扦插枝条为辐照材料研究辐照诱变效应及其耐辐照性，发现随辐照剂量的增大成活率有下降趋势，当辐照剂量超过35 Gy 时，桂花的成活率均低于50%。这些在对金银花[13]、扶芳藤[14]、栀子[15]等的研究中也有类似发现。60Co-γ射线辐照会对芽分生组织造成不同程度的损伤，直接导致芽萌发缓慢或芽不萌发，甚至芽直接死亡，插穗会因体内养分耗尽或细胞大量的损伤而死亡[16]。

此外，本试验根据辐照后插穗的相对成活率得出休眠枝插穗半致死剂量为28 Gy，嫩枝插穗的半致死剂量为31 Gy，不同扦插材料适宜辐照剂量具有差异性。前人在对荔枝枝条辐照研究中发现，不同品种、不同时期的荔枝枝条受60Co-γ射线辐照的耐受能力和变异差异区别很大，这种辐照敏感性差异的现象可能与植物的进化程度、倍性水平、核体积、生长及生理代谢状况等因素有关[17-18]。对于半致死剂量的确定，耿兴敏等[19]认为潢川金桂、米花籽银桂和金盏碧珠的适宜辐照剂量不能仅考虑发芽率，还需结合其出苗率及幼苗生长情况，适当降低辐照剂量，以保证出苗率。叶开玉认为[20]用相对成活率来确定辐照适宜剂量更为准确，可避免试验操作造成的误差和错误。但也有研究表明以半致死剂量上下20%的范围内再选择2个剂量，作为产生有益突变的最佳辐照剂量[21]。本研究采用扦插材料相对成活率50%的辐照剂量为半致死剂量，此次试验海州常山嫩枝扦插成活率偏低，这可能因为扦插季节不适宜，可适当推迟扦插时间来保证插穗的成活率。

60Co-γ射线辐照对植物的生长影响因材料的不同和辐照剂量大小而异。刘军丽[6]在研究苹果属观赏海棠中发现，100 Gy剂量的辐照会抑制其1年生枝新梢和叶片生长，使叶面积降低。在对金帅、嘎拉苹果1年生枝条辐照中也有类似报道，40～80 Gy范围内的辐照会使新生枝条变短，叶片变窄[22]。本试验中，15～35 Gy的60Co-γ射线辐照抑制了海州常山休眠枝插穗新梢长度、新梢基部粗度、叶面积及地下根系的生长，但15～35 Gy的辐照对嫩枝插穗无明显影响，仅对其地下根系总长度、总表面积和总体积的生长起到了一定的促进作用，这可能为本试验嫩枝插穗腋芽还处于被顶芽抑制的状态，对外界辐照刺激不敏感的缘故。这在仙客来[23]辐射育种中也有类似现象，辐射块茎比愈伤组织、体细胞胚等更能有效改变花色的性状。

此外，在一定的随辐照剂量范围内，枝、叶变异率随着辐照剂量的升高而升高，这与嘎拉苹果辐照效应研究结论相似，超出一定的剂量变异率会降低，高剂量辐照会提高插穗死亡率，从而降低了变异率[24]。辐照对叶片影响方面，库尔勒香梨[7,25]枝条在辐照剂量为20 Gy时变异率达30%，60 Gy时变异率达100%，变异叶片形态有两尖叶、半叶、叶片缺刻、叶缘波状等，此外还有叶序的紊乱等变异，变异类型多呈不规律变化。月季[26]植株经辐照叶片发生了叶柄发生粘连、叶片变得狭小、畸形等现象。本研究叶片变异情况与之相似。至于枝、叶变异类型发生辐照剂量之间的规律是否存在，尚待进一步研究。

本试验研究了60Co-γ射线对海州常山休眠枝、嫩枝插穗生长及变异的影响，为海州常山辐射育种提供了一定的理论基础。但随着生长进程的推迟，新生枝条、叶片变异性状逐渐消失，变异性状稳定性尚不明确，需逐代筛选，为加快辐射育种变异植株早期的筛选，可采用分子手段检测海州常山遗传分化状况。另外，海州常山辐射育种可以向抗虫害方向进行研究。