急性脑梗死患者血清miR-21和HIF-1α、VEGF-A的表达关系及临床意义

向 伟 魏新宇 余 彪

脑梗死(cerebral infarction)，又称缺血性脑卒中，是一常见的脑血管疾病[1]。我国脑梗死的发生率、致残率、病死率极高，且脑卒中发病年龄呈年轻化趋势[2]。由于脑血管疾病病理机制复杂、病情变化迅速，迄今仍缺乏有效的临床治疗手段。近来研究发现，血液中的某些生物标志物能够反映脑梗死病理生理变化情况，且它们在血液中表达水平的变化可能影响脑血管病的疾病进展、严重程度及疾病转归，在脑血管疾病的早期诊断、病因识别、个体化治疗中具有重要临床价值[3]。本研究旨在评估急性脑梗死患者血清miR-21和缺氧诱导因子(HIF)-1α、血管内皮生长因子(VEGF)-A的表达变化及关系，以期为急性脑梗死的临床诊疗提供一定参考价值。

材料与方法

1.一般资料：选取笔者医院2016年5月～2017年5月于神经内科治疗的急性脑梗死患者63例作为研究组，其中男性36例，女性27例，患者年龄49～83岁，平均年龄61.59±8.13岁。纳入标准：①急性脑梗死诊断符合第4次全国脑血管病会议急性脑梗死的临床诊断标准；②所有患者均经头颅CT或头颅MRI确诊；③患者均为首次发病入院；④所有患者均知情同意[4]。排除标准：①重大手术或有严重外伤；②急性脑卒中病史；③神经系统功能障碍；④恶性肿瘤患者。另选同期于笔者医院体检健康者60例作为对照组，其中男性34例，女性26例，年龄48～80岁，平均年龄58.96±9.21岁。本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准。

2.标本采集：脑梗死患者分别于发病后1、3、5、7、10天抽取空腹静脉血3ml，对照组清晨抽取空腹静脉血3ml。采集血样置于EDTA抗凝管中，3000r/min离心10min后，分离血清，于-80℃冰箱中保存。

3.脑梗死患者评分标准及分组：所有脑梗死患者于发病后2～3天内进行头颅CT或MRI检查，根据Pullicino公式，计算脑梗死灶面积[5]。脑梗死面积=长×宽×阳性扫描层数×π/6，其中长为梗死灶最大长径，宽为与长径垂直的直径。根据脑梗死病灶面积，将患者分为3组：梗死面积<4cm3，记为小梗死组，31例；梗死面积4～10cm3，记为中梗死组，21例；梗死面积>10cm3，记为大梗死组，11例。

4.荧光实时定量PCR法(RT-PCR)：采用荧光实时定量PCR法(RT-PCR)检测血清中miR-21表达水平。应用RNA提取试剂盒(美国Digma-Aldrich公司)提取血清总RNA，采用反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)进行反转录。U6 snRNA作为内源对照。本研究所有引物设计均交由上海生工公司合成。使用ABI PCR System7300扩增仪进行PCR反应，根据基因特异性引物分析miR-21表达。用2-ΔΔCt法计算miR-21相对表达水平。PCR反应体系：使用50μl PCR反应体系，10X Buffer 5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl,，taq酶0.5μl，Pmix2.5μl，上游引物和下游引物各1μl，ddH2O 36μl。PCR反应条件：94℃预变性2min，随后于94℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸20s，进行31个循环扩增PCR产物。取10μl PCR产物，应用Bio-Rad全自动电泳仪(USA)进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。miR-21扩增引物设计如下：上游引物：5′-GACTGAGTACAAACTGGTGG-3′；下游引物：5′-GGGCCTCACCTCTATGGTG-3′。

5.酶联免疫吸附(ELISA)：应用酶联免疫吸附法检测血清HIF-1α与VEGF-A浓度。HIF-1α与VEGF-A特异性ELISA检测试剂盒购自云南精赛顿生物制剂公司。所有操作严格按照试剂盒说明书进行。详细步骤如下：首先从平衡至室温的盒子中取出样品，其余部分置于4℃冰箱中。除空白孔外，将样品(100微升/孔)以及不同浓度的标准物质(100微升/孔)分别加入孔中，反应孔用胶纸密封。37℃温育浴90min后，将板洗涤4～6次。之后，用纸交将板干燥。除空白孔外，所有其他孔与生物素抗体(100微升/孔)混合，37℃反应30min。将板洗涤4次后，进行避光孵育20min。之后，每个孔依次加入100微升终止反应液混合以结束反应。将反应板放入酶标仪(BioTek Instruments，Burlington，VT)中，测量A450值。根据样品的A值对HIF-1α与VEGF-A含量进行计数，然后乘以样品的稀释比，获得样品HIF-1α与VEGF-A的实际浓度。将平均值作为相对数量。

结 果

1.两组受试者一般临床资料比较：两组患者性别、年龄、吸烟、喝酒等一般资料以及临床血液生化指标比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 两组受试者一般临床资料比较

2.两组受试者血清miR-21、HIF-1α和VEGF-A水平变化比较：与对照组比较，在1、3、5、7、10天，研究组血清miR-21、HIF-1α、VEGF-A表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。在急性脑梗死发作后1天，患者血清miR-21、HIF-1α、VEGF-A表达水平达到最高，随着发病后时间的延长(1天→3天→5天→7天→10天)，研究组患者血清miR-21、HIF-1α、VEGF-A表达水平均逐渐降低。详见表2。

3.急性脑梗死患者不同体积组血清miR-21表达水平变化：研究组患者在急性脑梗死发作后的1、3、5、7、10天，与小梗死组比较，中梗死组患者血清miR-21表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与中梗死组比较，大梗死组患者血清miR-21表达水平均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

4.急性脑梗死患者不同体积组血清HIF-1α表达水平变化：研究组患者在急性脑梗死发作后的1、3、5、7、10天，与小梗死组比较，中梗死组患者血清HIF-1α表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与中梗死组比较，大梗死组患者血清HIF-1α表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05，表4)。

表2 两组受试者血清miR-21、HIF-1α和VEGF-A水平变化比较

表3 急性脑梗死患者不同体积组血清miR-21表达水平变化

表4 急性脑梗死患者不同体积组血清HIF-1α表达水平变化

5.急性脑梗死患者不同体积组血清VEGF-A表达水平变化：研究组患者在急性脑梗死发作后的1、3、5、7、10天，与小梗死组比较，中梗死组患者血清VEGF-A表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与中梗死组比较，大梗死组患者血清VEGF-A表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05，表5)。

表5 急性脑梗死患者不同体积组血清VEGF-A表达水平变化

6.急性脑梗死患者血清miR-21和HIF1-α、VEGF-A水平的相关性分析：Spearman相关性分析显示，研究组患者发病后，血清miR-21与HIF-1α水平呈明显正相关(r=0.515，P<0.05)，miR-21与VEGF-A水平呈明显正相关(r=0.553，P<0.05)，HIF-1α与VEGF-A水平呈明显正相关(r=0.726，P<0.05，图1)。

图1 急性脑梗死患者血清miR-21和HIF-1α、VEGF-A水平的相关性分析

讨 论

微小RNA(miRNA)是长21～25nt的非编码RNA分子，其通过靶向结合mRNA的3′非翻译区(3′UTR)来抑制转录和转录后水平的基因表达，从而参与调节人类胚胎发育、细胞分化、代谢、肿瘤形成等多种生物学过程。miRNA具有广泛的基因调节能力，每种miRNA可以调控多个靶基因，同样，每种mRNA也可以受多种miRNA调节，这种复杂的调节网络使miRNA表现出多样性功能，从而参与多种信号转导通路。最近研究发现，在脑血管疾病的发生、发展过程中，miRNA广泛参与动脉粥样硬化、脑缺血缺氧耐受、脑水肿、神经保护等多种病理生理过程[6，7]。

大量动物和临床研究发现，miRNA表达谱在发生脑卒中的脑组织和血液中呈现异常变化，提示miRNA参与脑卒中的病理生理过程。Jeyaseelan等[8]发现，大鼠缺血再灌注后脑组织中多种miRNA表达谱发生特异性变化，且在缺血脑组织中高表达的miRNA可在血液中检测到，其变化与脑缺血损伤的生物标志物基质金属蛋白酶-9变化一致。Liu等[9]发现，成年大鼠脑梗死后，脑组织和血清内miR-298、miR155、miR3256等多种miRNA表达水平均显著上调或下调。这些结果均显示，脑梗死后，血液内miRNA和脑组织内miRNA变化一致，即血清中miRNA的变化可以反映脑组织中miRNA变化，提示，血清miRNA水平的变化可以作为脑梗死的潜在新型生物标志物。Gan等[10]发现，脑梗死患者血液中miR-145表达水平明显增加，高表达的miR-145通过促进神经嵴干细胞向血管平滑肌细胞表型转化，从而促进血管内皮细胞重建，并提出miR-145可能成为第1个缺血性脑卒中的潜在血清生物标志物。Zeng等[11]发现，急性脑梗死患者外周血miR-210表达水平显著降低，且在患病后第7天和14天变化明显，并提出miR-210动态变化与患者脑梗死严重程度有关。Tsai等[12]发现，缺血性脑血管疾病患者的血清中miR-21表达水平显著升高，可能作为预测脑血管疾病的潜在生物标志物。与此一致，本研究发现急性脑梗死患者血清miR-21水平显著增加，血清中miR-21的增加可能预示着急性脑梗死的发生。在脑梗死急性期的同一时间点，随着脑梗死面积的增加，miR-21表达水平逐渐增加，这提示miR-21在急性脑梗死患者血清中表达水平的增加与疾病严重程度有关，有可能作为急性脑梗死的潜在生物标志物。

缺氧诱导因子(HIF-1)是目前发现唯一在特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子。研究表明，脑梗死的病理过程中，脑组织由于缺氧而产生较高水平HIF-1，HIF-1进一步与其亚单位结合，形成有活性的HIF-1α并分泌致血液中，使外周血HIF-1α水平增加，并激活相关靶基因的转录，使血管内皮生长因子(VEGF)及其他下游因子表达水平增加，从而修复损伤血管的内皮，促进新生血管形成，并刺激红细胞再生[13]。HIF-1作为低氧应答时基因表达和恢复内环境稳定的调节中心，脑梗死后其表达水平的增加对机体起积极保护作用，以减轻缺血、缺氧后的不良反应[14～16]。VEGF作为HIF-1转录因子的下游靶基因，在新血管形成之前对神经组织起直接保护作用。研究发现，机体缺氧时，HIF-1α激活VEGF的转录，从而使VEGF的生物活性增加。在缺血导致的脑组织损伤中，VEGF活性的增加能够促进内皮细胞的增殖、迁移和新血管生成[17,18]。这些研究提示，在脑梗死后，HIF-1与VEGF在分子水平上的变化，使机体对缺血环境产生适应性变化，以减轻缺血、缺氧对机体的损伤。

李建军等[19]发现，急性脑梗死患者发病后1、3、7天，血清HIF-1α和VEGF水平均显著增加。与此一致，廖彬等[20]发现，急性脑梗死患者发病后1天，HIF-1α和VEGF表达水平达到高峰，在3、5、7、14天，HIF-1α表达水平虽逐渐降低，但仍显著高于对照组。本研究发现，急性脑梗死患者发病1、3、5、7、10天后，血清HIF-1α和VEGF-A表达水平均显著高于对照组，与以往研究结果一致。

谭新杰等[21]发现，在成年大鼠局灶性脑梗死的治疗中，HIF-1α基因治疗能够通过修复和保护脑组织神经元，降低脑梗死面积而发挥急性脑梗死治疗作用。Yang等[22]发现，VEGF表达水平的降低能够使脑缺血引起的梗死体积增加，并提出内源性VEGF在缺血脑组织中表达水平的增加与神经保护作用有关。这些研究提示脑梗死面积与HIF-1α和VEGF表达水平的变化有关。本研究发现，在脑梗死急性期的同一时间点，脑梗死面积越大，HIF-1α和VEGF表达水平越高，提示脑梗死病灶面积可能影响血清HIF-1α和VEGF的表达水平。进一步进行相关性分析发现，HIF-1α与VEGF-A呈明显正相关。这些结果表明，梗死面积越大，脑细胞及周围脑组织水肿程度和缺氧状况越严重，从而导致HIF-1α被大量激活，患者血清HIF-1α含量上升越明显，进而刺激其下游靶点VEGF的转录，使VEGF-A表达水平逐渐增加。

大量研究已证实miR-21与缺氧有关[23]。Song等[24]发现miR-21过表达能够使PTEN降低、p-Akt升高，随后使HIF-1α表达增加，而miR-21抑制则导致PTEN升高、p-Akt降低，从而使HIF-1α降低，推断HIF-1α表达水平的上调与miR-21的过表达有关。与此一致，Liu等[25]发现在缺氧条件下，miR-21通过调控PTEN/Akt信号途径调节HIF-1α表达。陈惠军等[26]发现在缺血缺氧情况下，miR-21表达水平上调，使HIF-1α表达上调，从而发挥脑组织保护作用。本研究进行相关性分析发现，在急性脑梗死患者中，miR-21与HIF-1α及VEGF-A表达水平均呈显著正相关。结合过往研究推测，在脑梗死急性发作期，患者脑组织出现缺血缺氧情况，miR-21表达的上调使HIF-1α表达水平增加，HIF-1α作为转录因子，激活VEGF基因转录，从而使VEGF表达水平增加，从而使机体对缺血环境产生适应性变化。

综上所述，在急性脑梗死患者血清中miR-21、HIF-1α和VEGF表达水平的增加与疾病严重程度有关，且三者在急性脑梗死中存在相关性，可作为判断脑损伤的潜在生物学标志物。