利用流式细胞法鉴定马铃薯倍性方法的优化

王婷婷，张光海，蔡汶玻，郭华春

（云南农业大学，云南 昆明 650201）

流式细胞法（Flow cytometry，FCM）是利用流式细胞分析仪检测植物细胞DNA含量，分析得到DNA含量直方图，根据DNA含量直方图的峰值位置推断出植株的倍性。由于细胞在有丝分裂的过程中，核内的DNA会进行复制，造成DNA含量的变化。如果把处于G0/G1期的细胞的DNA含量看作2n的话，处于G2/M期的细胞的DNA含量则为4n，所以FCM可以准确快速地鉴定大批量植物材料的染色体倍性水平[1,2]。流式细胞术可以测定液体悬浮液中荧光和微小粒子的光散射（荧光标记的微粒）。由于其快速准确的特点，FCM在20世纪80年代，代替细胞荧光光度法和显微分光光度测定法，成为测定植物细胞核DNA含量的主流方法，其原理是利用特异的荧光染色剂对细胞进行染色，通过流式细胞仪测定荧光含量[3,4]。由于所使用的荧光染色剂大多为核酸荧光染料，可以与细胞内DNA碱基特异性结合，所以荧光的含量与细胞DNA含量成正比关系，随着染色体数目的成倍增加，细胞核DNA含量也必然成倍增加，细胞核DNA相对含量的高低与细胞的倍性密切相关，根据细胞核DNA含量的高低可进行倍性鉴定。常用的荧光染料有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、异硫氰基荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）等[5-7]。FCM短时间内可以测定大量的细胞核，样品需求量小，不会影响植物的正常生长。且样品制备仅需要几分钟，而且不需要昂贵的试剂。流式细胞术简便、快速、分辨率和准确度高，鉴于这些优点，已经在多种植物的染色体倍性鉴定中得以应用。例如，苹果[5]、梨[8]、桑树[9]、菘蓝[10]、草莓[11]、 水稻[12]、樱桃[13]等。

马 铃 薯（Solanum tuberosum L.）属 于 茄 科（Solanaceae）茄属（Solanum）一年生，草本植物，起源于南美洲的秘鲁和智利地区[14]。马铃薯普通栽培种分为2个亚种，分别为长日照普通栽培种亚种（S.tuberosum subsp.tuberosum）和短日照安第斯亚种（S.tuberosum subsp.andigena），经过几个世纪的自然进化选择，形成了目前世界各国广泛栽培的普通栽培种（Solanum tuberosum L.）[15]。马铃薯倍性丰富，染色体基数为n=12，自然界中分布有二倍体（2n=24）、三倍体（2n=36）、四倍体（2n=48）、五倍体（2n=60）、六倍体（2n=72）[16]。这些是改善栽培马铃薯的重要基因资源，可以为育种工作提供具有理想遗传背景的材料，而马铃薯的倍性鉴定则是开展野生种马铃薯育种应用研究的基础和前提[17,18]。

尽管关于马铃薯倍性鉴定方法已有很多研究报道，但利用流式细胞法鉴定马铃薯倍性方面的报道仍然较少。本试验借鉴流式细胞法在其他植物染色体倍性鉴定方面的研究，通过筛选适合制备马铃薯幼叶单细胞核悬浮液的缓冲液，比较离心和不离心及不同染料对结果的影响，期望利用流式细胞术建立一套适合鉴定马铃薯染色体倍性的方法，快速准确地鉴定马铃薯倍性，从而为马铃薯的倍性研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

二倍体马铃薯品系‘E’和四倍体马铃薯‘青薯9号’为研究对象，取在MS培养基中正常生长3周左右的幼嫩叶片为试验材料。流式细胞仪（BD FACSAriaTMⅡ）。

1.2 细胞核分离缓冲液的配制

细胞核分离缓冲液Ⅰ（LB01）：15 mmol/L Tris，2 mmol/L Na2EDTA，0.5 mmol/L腈胺，80 mmol/L KCl， 20 mmol/L NaCl， 0.1%（v/v）Trition X-100，用1 mol/L NaOH调节pH至7.5，0.22 μm滤膜过滤除菌，再加15 mmol/L β-巯基乙醇；分装后-20℃保存。

细胞核分离缓冲液Ⅱ（Galbraith's buffer）：45 mmol/L MgCl2，20 mmol/L MOPS，30 mmol/L柠檬 酸 钠 ， 0.1%（v/v）Trition X-100； 用 1 mol/L NaOH调节pH至7.0，0.22 μm滤膜过滤除菌；分装后-20℃保存。

细胞核分离缓冲液Ⅲ（Tris·MgCl2buffer）：200mmol/L Tris， 4 mmol/L MgCl2， 0.5%（v/v）Trition X-100；用1 mol/L HCl调节pH至7.5，0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

1.3 马铃薯叶片细胞核悬浮液的制备

选用上述3种核分离缓冲液，取约20 mg正常生长3周左右的马铃薯‘E’组培苗叶片，置于预冷的培养皿中央，加入1 mL预冷的核分离缓冲液，使材料完全浸没在解离液中，然后用锋利的双面刀片迅速切碎，切的过程中样品应始终接触缓冲液。将匀浆混匀，避免产生气泡。将预先浸泡在解离液中400目的滤膜取出，用此滤膜将匀浆过滤到1.5 mL离心管中[19]。

1.4 离心漂洗次数选择

采用1.3的方法，加入1 mL预冷的LB01缓冲液，分别进行不离心和离心1次的比较试验。离心1次的试验条件为4℃，1 000 r/min，离心5 min，弃去上清，再加200 μL LB01缓冲液。

1.5 染色剂的选择

在用LB01缓冲液制备的单细胞核悬浮液中，分别加入 PI（50 μg/mL）染料和 DAPI（5 μg/mL）染料，注意加PI染料的核悬浮液中要同时加入质量浓度为50 μg/mL的核糖核酸酶（RNase）。4℃避光染色30 min，并轻摇混匀。

1.6 上机检测与数据分析

用BD FACSAriaTMⅡ流式细胞仪进行检测，调节参数，每个经过染色的样品收集10 000个细胞核，利用FlowJo软件进行数据分析，从而获得流式峰值图（横坐标为细胞核DNA相对含量的荧光强度，纵坐标为细胞核数量）和散点图（横坐标为细胞的总荧光强度，纵坐标为细胞通过激光的时间）。

2 结果与分析

2.1 不同缓冲液的效果比较

图1 不同解离液下二倍体马铃薯品系‘E’单细胞核悬浮液的相对DNA含量直方图和散点图Figure 1 Peak valuehistogram and scatter diagram ofsinglecellsuspension solution for relativeDNA contentsusing different dissociation buffersin diploid potato line'E'

取约20 mg正常生长3周左右的二倍体马铃薯品系‘E’组培苗幼嫩叶片，分别用核分离缓冲液Ⅰ（LB01）、核分离缓冲液Ⅱ（Galbraith's buffer）和核分离缓冲液Ⅲ（Tris·MgCl2buffer）制备马铃薯单细胞核悬浮液，检测结果见图1。使用3种缓冲液制备的马铃薯幼叶细胞核悬浮液，经流式细胞仪检测均可产生非常明显的峰。核分离缓冲液Ⅰ（LB01）（图1-a）的解离效果明显优于Galbraith's buffer（图 1-b）和 Tris·MgCl2buffer（图 1-c）。LB01解离液得到的散点图中，粒子团清晰、集中，2个细胞群可以完全分开，收集到的完整细胞核较多，在荧光通道值为200处附近出现G1峰，G1峰和G2峰可以完全分开，峰值较为准确（图1-a-2）。而Galbraith's buffer和Tris·MgCl2buffer制备的核悬浮液中（图1-b-2和图1-c-2），2个细胞群不能完全分开，反映在直方图上则表现为G1峰和G2峰不能完全分开，主峰位置明显发生偏移。因此，核分离缓冲液LB01可作为制备马铃薯幼叶单细胞核悬浮液的最优解离液。

2.2 离心和不离心的效果比较

取二倍体马铃薯品系‘E’组培苗新鲜幼嫩叶片制备的马铃薯单细胞核悬浮液，进行不离心（图2-a）和离心1次（图2-b）的试验，检测结果如图2所示。从图2-a-2和图2-b-2看出两者均表现为粒子团集中、清晰，2个细胞群可以完全分开，反映在直方图上则表现为G1峰和G2峰可以完全分开，但离心得到的悬浮液中完整细胞核少于不离心得到的。

从提高试验效率和节约试验成本来说，应采用不离心的方法制备马铃薯单细胞悬浮液。

图2 不同离心次数制备二倍体马铃薯品系‘E’的相对DNA含量直方图和散点图Figure 2 Peak value histogram and scatter diagram for relative DNA contents using different centrifugation times in diploid potato line'E'

2.3 不同染料的效果比较

取二倍体马铃薯品系‘E’组培苗新鲜幼嫩叶片制备的单细胞核悬浮液，分别用PI（50 μg/mL）染料和DAPI（5 μg/mL）染料进行染色试验，检测结果如图3所示。PI染料和DAPI染料对马铃薯单细胞核悬浮液的制备无明显差异，处理后得到的完整细胞核均较多，粒子团清晰集中，背景碎片少，2个峰可以完全分开。

2.4 马铃薯品种‘青薯9号’的倍性分析

图3 不同染料制备二倍体马铃薯品系‘E’幼叶的相对DNA含量直方图和散点图Figure 3 Peak value histogram and scatter diagram for relative DNA contents using different fluorescent dyes in diploid potato line'E'

图4 流式细胞术检测二倍体马铃薯品系‘E’（a）和四倍体品种‘青薯9号’（b）的相对DNA含量Figure 4 Peak value histogram for relative DNA contents of diploid potato line'E'(a)and tetraploid variety'Qingshu 9'(b)by flow cytometry

利用以上所得的最优试验方案，取大约20 mg正常生长3周左右的‘青薯9号’组培苗幼嫩叶片，置于预冷的培养皿中央，加入1 mL预冷的核分离缓冲液LB01，然后用锋利的双面刀片迅速切碎，将匀浆混匀，随后用预先浸泡在解离液LB01中的400目滤膜将匀浆过滤到1.5 mL离心管中。加入10 μL预冷的质量浓度为50 μg/mL PI的染料，同时加入质量浓度为50 μg/mL的RNase，避光染色30～60 min，最后流式细胞仪上样检测。以二倍体马铃薯品系‘E’作为对照，将‘青薯9号’的核DNA含量与二倍体马铃薯‘E’相比较，结果如图4。二倍体马铃薯‘E’的细胞核荧光强度在200道附近有明显的峰，而‘青薯9号’在400道附近出现明显的峰，为二倍体马铃薯‘E’的2倍，符合四倍体核DNA的特征。以上建立的方法适合进行马铃薯的倍性分析。

3 讨 论

在利用流式细胞术鉴定染色体倍性的试验中，由于只利用物理方法切碎叶片，很难获得大量的完整的细胞核。因此，还需要加入核分离缓冲液[20]。但是，对于不同科、属和种的植物来说，在提取单细胞核悬浮液时，需要的解离液也是不同的。如果解离液不适合，会加速细胞核破裂，导致碎片增多。因此，选择适合本试验材料的解离液尤为重要。例如，杨静等[9]利用MgSO4缓冲液成功鉴定了桑树的染色体倍性；马艳芝和客绍英[10]利用LB01解离液成功鉴定了菘蓝的染色体倍性；在本文中，利用3种核分离缓冲液制备马铃薯幼嫩叶片的单细胞核悬浮液，结果表明，解离液LB01的效果最好，所得到的单细胞核悬浮液中，有较多的完整细胞核，而且背景碎片较少，峰图清晰。另外，LB01缓冲液也适应于苹果的染色体倍性鉴定[5]。所以，在利用流式细胞术鉴定马铃薯染色体倍性时，选择LB01缓冲液来制备核悬浮液。

由于植物的组织结构不同，会采用不同的离心次数。于红梅等[11]采用离心2次和离心3次的方法处理草莓单细胞核悬浮液，发现两者相比，离心3次的效果更好，碎片较少，流式直方图更清晰，还可以减少对仪器的堵塞。杨静等[9]比较了不离心、离心1次、离心2次对桑树染色体倍性鉴定结果的影响，发现3种离心方式对结果并无显著影响，认为采用不离心的方法制备桑树的单细胞悬浮液，既可以提高试验效率又可以简化试验操作步骤。吴雅琴等[13]利用流式细胞术鉴定甜樱桃砧木细胞核DNA含量和染色体倍性的试验中，采用不离心的方式处理甜樱桃砧木单细胞核悬浮液，效果显著，鉴定出了不同砧木品种的倍性。朱道圩等[21]则发现离心2次对中华猕猴桃染色体倍性鉴定效果好。本文比较了不离心和离心1次对马铃薯叶片单细胞核悬浮液制备效果的影响，发现离心之后，虽然粒子团也清晰集中，但目的细胞略少于不离心组，可能是离心过程中丢失了部分目的细胞。故选择不离心的方式制备马铃薯叶片单细胞核悬浮液。PI染料不仅可以与DNA结合而且还能与RNA结合，所以用PI进行染色的时候要同时加入RNase。而DAPI仅与DNA结构中的A-T区域结合，与RNA没有结合位点。从试验结果来看，2种染料的效果差异不大，所以今后的的试验既可以选择PI又可以选择DAPI作为荧光染料。

在本试验中，通过对马铃薯幼嫩叶片的不同处理与结果分析，总结出一套利用流式细胞术鉴定马铃薯染色体倍性的方案：取大约20 mg正常生长3周左右的马铃薯组培苗幼嫩叶片，置于预冷的培养皿中央，加入1 mL预冷的核分离缓冲液LB01，用锋利的双面刀片迅速切碎，然后将匀浆混匀，用预先浸泡在解离液LB01中的400目滤膜将匀浆过滤到1.5 mL离心管中。加入10 μL预冷的PI（50 μg/mL）染料，同时加入RNase（50 μg/mL），避光染色30～60 min，最后流式细胞仪上样检测。

采用流式细胞术鉴定马铃薯染色体倍性，所需材料用量少，速度快，短时间内便可鉴定出植株倍性，可以为马铃薯的倍性研究提供实验依据。